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菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的研究

2021-05-24 15:29:26      點擊:

摘要:為研究固態(tài)發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件,本試驗以木聚糖含量為指標(biāo),采用單因素試驗,依次研究單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、菌種比例、單酶發(fā)酵、雙酶發(fā)酵、雙酶比例、酶的用量對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響。

結(jié)果表明:發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為:枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1:9,發(fā)酵時添加纖維素酶量為1000U/g飼料。在此條件下,木聚糖含量可達(dá)1.421mg/g,與對照組相比顯著提高了257%。

木聚糖是以β-(1,4)-D-吡喃型木糖構(gòu)成主鏈,以4-0-甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖(陳國榮等,2009)。木聚糖經(jīng)酶解可用于制備低聚木糖,機(jī)體攝入低聚木糖可顯著促進(jìn)腸道益生菌的生長。提取木聚糖主要有以下幾種方法:酸水解法(徐曉燕等,2007)、堿液提取法(石波,2001)、蒸汽爆破法(張帆,2013)、蒸煮提取法(趙建等,2004)、預(yù)處理-酶水解法(楊瑞金等,2007)等。玉米芯是制備木聚糖的理想原材料之一,據(jù)統(tǒng)計,我國每年有2000萬噸以上的玉米芯副產(chǎn)物,可以為木聚糖的制備提供豐富的原料資源(孫軍濤等,2015)。近年來,微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)被應(yīng)用于制備木聚糖,本試驗以發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量為評價指標(biāo),研究單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、菌種比例、單酶發(fā)酵、雙酶發(fā)酵、雙酶比例、酶用量對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響,為玉米芯的綜合利用及木聚糖的制備提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌均購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 原料 

玉米芯、豆粕、麩皮均購于市場,粉碎過篩。纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶均購買于濟(jì)南諾能生物工程有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,MRS肉湯培養(yǎng)基,麥芽汁培養(yǎng)基均購自廣東某生物科技有限公司。固體發(fā)酵培養(yǎng)基:80%玉米芯,10%豆粕,10%麩皮。

1.4 儀器 

JJ-CJ-1F超凈工作臺、TG16-WS臺式高速離心機(jī)、SYQ-DSX-28OB手提式壓力蒸汽滅菌器、CP224C電子天平、GX2智力光照培養(yǎng)箱、Epoch2酶標(biāo)儀等。

2 方法

2.1 菌種的活化及種子液的制備

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的營養(yǎng)瓊脂平皿中劃線,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待長出菌落后,挑取單個菌落于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置于搖床37℃,120r/min培養(yǎng)24h,即為種子液。

植物乳桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的MRS肉湯瓊脂平皿中劃線,36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待長出菌落后,挑取單個菌落于滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中,置于搖床36 ℃,120r/min培養(yǎng)24h,即為種子液。

酵母菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的麥芽汁瓊脂平皿中劃線,28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后,挑取單個菌落于滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中,置于搖床28℃,120 r/min培養(yǎng)24h,即為種子液。

2.2 試驗設(shè)計

本試驗玉米芯固態(tài)發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度36℃,發(fā)酵時間72h,裝料量50g,料水比1:1,接種量10%,初始pH為自然pH。以木聚糖含量為指標(biāo),采用單因素試驗依次確定出最佳的發(fā)酵菌種比例和商品酶種類及用量。

2.3 木聚糖提取液的制備

固態(tài)發(fā)酵后,將發(fā)酵產(chǎn)物與無菌蒸餾水以1:10的比例裝人三角瓶中,置于37 ℃的恒溫水浴搖床以135r/min振蕩1h,然后5000r/min,4℃離心10min,提取上清液待測。

2.4 檢測指標(biāo)

還原糖測定方法:3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)。

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式中:m為還原糖的質(zhì)量;M為待測產(chǎn)物的質(zhì)量(丁勝華等,2010)。

3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復(fù)三次,試驗結(jié)果運(yùn)用SASS 9.2軟件,采用單因子方差分析(ANO-VA)并用Duncan’s方法對各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并繪圖。

結(jié)果與分析

1 單菌發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌分別發(fā)酵玉米芯,發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖1,對照組為不加菌發(fā)酵。

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由圖1可知,四株菌都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量,其中枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高,為0.764mg/g,與對照組相比提高了282%(P<0.05),故確定單菌最佳發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌。

2 雙菌發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

枯草芽孢桿菌分別與地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌組合發(fā)酵玉米芯,發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖2,對照組為不加菌發(fā)酵。

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由圖2可知,三種菌種組合都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量,其中枯草芽孢桿菌和酵母菌組合發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高,為0.991mg/g,與對照組相比提高了395%(P<0.05),故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的組合為發(fā)酵玉米芯的最佳菌種組合。

3 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

枯草芽孢桿菌與酵母菌以不同比例發(fā)酵玉米芯,發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量見圖3,對照組為不加菌發(fā)酵。

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由圖3可知,枯草芽孢桿菌與酵母菌以任何比例接種都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量,其中當(dāng)枯草芽孢桿菌與酵母菌的比例為1:9時,發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高,為1.108mg/g,與對照組相比提高了454%(P<0.05),故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例為1:9。

4 單酶發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

發(fā)酵玉米芯時,分別添加纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶,發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖4,對照組為不加酶發(fā)酵。

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由圖4可知,發(fā)酵時添加這四種酶都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量,其中添加纖維素酶的發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高,為1.319mg/g,與對照組相比提高了 231%(P<0.05),故確定最佳發(fā)酵單酶為纖維素酶。

5 雙酶發(fā)酵玉米芯對發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

纖維素酶分別與木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶組合發(fā)酵玉米芯,發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖5,對照組為不加酶發(fā)酵。

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6 纖維素酶與木聚糖酶的比例對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

纖維素酶與木聚糖酶以不同比例發(fā)酵玉米芯,發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量見圖6, 對照組為不加酶發(fā)酵。

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由圖6可知,纖維素酶與木聚糖酶以任何比例都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量,其中當(dāng)纖維素酶與木聚糖酶的比例為1:0時,發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高,為1.498mg/g,與對照組相比提高了276%(P<0.05),故確定纖維素酶與木聚糖酶的比例為1:0,即纖維素酶為最佳發(fā)酵添加酶。

7 纖維素酶的添加量對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響

纖維素酶以不同添加量發(fā)酵玉米芯,發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖7,對照組為不加酶發(fā)酵。

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由圖7可知,纖維素酶以任何添加量都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量,其中當(dāng)纖維素酶添加量為1000U和4000U時,發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高,分別為1.421、1.446mg/g,與對照組相比分別提高了257%、263%,但差異不顯著(P>0.05),考慮到成本,故選擇纖維素酶最適添加量為1000U/g飼料。

討論

玉米芯是木聚糖含量最高的農(nóng)副產(chǎn)品,含量為35%〜40%,是制備木聚糖的最佳原料。李里特(2004)、楊瑞金(2000)、邵佩蘭等(2000)利用不同的提取方法證明,從玉米芯中提取木聚糖是可行的,而且提取率較高,羅曉風(fēng)(2005)等用堿法提取木聚糖的得率為22.7%。本試驗結(jié)果表明,在枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1:9,發(fā)酵時添加纖維素酶量為1000U/g飼料的條件下,木聚糖含量可達(dá)1.421mgg,與對照組相比顯著提高了257%。

玉米芯中主要的多糖為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,半纖維素主要是由木聚糖組成,因此半纖維素含量的高低直接決定著木聚糖的得率。由于纖維素與半纖維素、木質(zhì)素等以多種物理或化學(xué)作用結(jié)合,形成致密的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu),單純使用酶降解玉米芯會導(dǎo)致酶解效率不高,生產(chǎn)成本增大(何亮亮,2012)。因此,要保證在實際生產(chǎn)中纖維素酶有較高的酶解效率,必須消除木質(zhì)纖維在結(jié)構(gòu)上的酶解障礙,因而在對木質(zhì)纖維進(jìn)行酶解之前,采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行預(yù)處理是必要的。常用方法之一是利用細(xì)菌、真菌等微生物的降解作用達(dá)到去除木質(zhì)素,使纖維組織松散的目的。Zhang等(2007)用白腐菌處理的竹子降解后的還原糖得率是未處理樣品的2.34倍,顯示出較好的處理效果。枯草芽孢桿菌與酵母菌是微生物發(fā)酵技術(shù)常用的發(fā)酵菌種,都具有產(chǎn)纖維素酶的能力(甄玉國,2005;Antonio等,2004),本試驗通過使用枯草芽孢桿菌、酵母菌與纖維素酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯,可以降解玉米芯中部分半纖維素使其表面出現(xiàn)空隙,增加酶和纖維素的可接觸面積,從而提高酶解率及木聚糖產(chǎn)量(鄭志,2012)。本試驗可為菌酶協(xié)同制備木聚糖的研究提供一些理論依據(jù)。

結(jié)論

在本試驗條件下,發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為:枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1:9,發(fā)酵時添加纖維素酶量為1000U/g飼料。在此條件下,木聚糖含量可達(dá)1.421mg/g,與對照組相比顯著提高了257%。


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