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復合菌生物飼料包含幾個微生物群：酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌以及雙岐桿菌等。這種微生物群在生命活動中產生的多種酶，如淀粉酶、胃蛋白酶等，將飼料中的淀粉、蛋白質等大分子有機物質降解為小分子的單糖、雙糖、各種氨基酸及其他營養物質，使畜禽更易于吸收。

植物乳桿菌是一種常見于面包、肉類及許多蔬菜發酵制品中的乳酸菌，能通過胃并定植于腸道發揮有益作用。它對腸道微生物有重要影響，在食品發酵和工業乳酸發酵領域有著廣泛的應用。酵母是一類結構簡單的真菌類微生物，廣泛應用于食品和飼料工業。一些科學研究發現，酵母菌或其提取的甘露糖蛋白具有顯著非特異性免疫調節和營養功能。腐植酸鈉作為一種新型的飼料添加劑廣泛應用于飼料工業。本試驗以玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麩皮、稻殼和糖蜜為原料配制培養基，以植物乳桿菌與酵母菌為發酵菌種，通過探索發酵產物中的活菌數來研究復合菌生物飼料發酵的最適條件。

１.１　材料

１.１.１　菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus　plantarum），由北京和美科盛生物技術有限公司保存并提供。酵母菌由內蒙古斯隆生物技術有限責任公司保存與提供。

１.１.２　原料

玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麩皮、稻殼和糖蜜由內蒙古斯隆生物技術有限責任公司提供。腐植酸鈉由內蒙古永業生物技術有限責任公司提供。

１.１.３　培養基

ＭＲＳ液體培養基（１Ｌ）：蛋白胨１０ｇ，牛肉膏５ｇ，酵母粉４ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐溫－８０１ｇ，磷酸氫二鉀２ｇ，檸檬酸氫二氨２ｇ，乙酸鈉５ｇ，硫酸鎂０．２ｇ，硫酸錳０．０５ｇ，蒸餾水１０００ｍｌ。植物乳桿菌斜面培養基（１Ｌ）：在ＭＲＳ液體培養基的基礎上加２％瓊脂粉，在溫度１２１℃條件下滅菌１５ｍｉｎ。酵母菌培養基：麥芽汁培養基和麥芽汁瓊脂培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司。原料發酵培養基（１ｋｇ）：玉米皮３５０ｇ，棉籽粕８０ｇ，玉米粉１００ｇ，麩皮１７０ｇ，稻殼２００ｇ，糖蜜１００ｇ。

１.１.４　儀器

恒溫培養箱、恒溫振蕩器、超凈工作臺、分析天平（感量０.０００１ｇ）、粉碎機和蒸汽滅菌鍋等。

１.２　方法

１.２.１　菌種的活化及種子液的制備

植物乳桿菌：將冷凍保存的菌種接種于ＭＲＳ斜面培養基中，３７℃靜置培養４８ｈ；待形成菌落后挑取單個菌落接種于ＭＲＳ液體培養基中，在溫度３７℃條件下培養２４ｈ，即得種子液。

酵母菌：將冷凍保存的菌種接種于麥芽汁瓊脂斜面培養基中，３２℃靜置培養４８ｈ，待形成菌落后挑取單個菌落接種于麥芽汁液體培養基中，在溫度３２℃條件下振蕩培養２４ｈ，即得種子液。

１.２.２　實驗設計

１.２.２.１　菌種比例的優化

在基礎培養基不變的條件下，設置植物乳桿菌和酵母菌不同的菌種比例，分別為１︰９、３︰７、１︰１、７︰３和９︰１，其他發酵條件一致，最后裝入規格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態發酵，發酵３６ｈ后通過測定發酵產物中的活菌數來確定最佳菌種比例。

１.２.２.２　裝料量的優化

在基礎培養基不變的條件下，設置不同的裝料量，分別為３０、４０、５０、６０和７０ｇ，其他發酵條件一致，最后裝入規格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態發酵，發酵３６ｈ后測定發酵產物中活菌數，以確定最佳裝料量。

１.２.２.３　發酵底物含水量的優化

在基礎培養基不變的條件下，設置發酵底物不同的含水量，分別為４０％、４５％、５０％、５５％和６０％，其他發酵條件一致，最后裝入規格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態發酵，發酵３６ｈ后通過測定發酵產物中的活菌數來確定發酵底物的最佳含水量。

１.２.２.４　發酵溫度的優化

在基礎培養基不變的條件下，設置不同的發酵溫度，分別為２６、３０、３４、３８和４２℃，其他發酵條件一致，最后裝入規格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態發酵，發酵３６ｈ后通過測定發酵產物中的活菌數來確定發酵的最佳溫度。

１.２.２.５　發酵菌種接種量的優化

在基礎培養基不變的條件下，設置不同的菌種接種量，分別為６％、８％、１０％、１２％和１４％，其他發酵條件一致，最后裝入規格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態發酵，發酵３６ｈ后通過測定發酵產物中的活菌數來確定菌種的最佳接種量。

１.２.２.６　腐植酸鈉添加量的優化

在基礎培養基不變的條件下，設置腐植酸鈉不同的添加量，分別為２％、４％、６％、８％和１０％，其他發酵條件一致，最后裝入規格為２５０ｍｌ的錐形瓶中進行固態發酵，發酵３６ｈ后通過測定發酵產物中的活菌數來確定發酵底物的最佳腐植酸鈉添加量。

１.２.３　分析方法

活菌數的測定：稱取５ｇ發酵產物溶于４５ｍｌ滅菌的生理鹽水中，振蕩混勻，靜置，吸取上清液分別進行乳酸菌和酵母菌活菌數的測定，采用平皿稀釋涂布計數法。

２.１　菌種比例的優化

植物乳桿菌和酵母菌分別以不同的接種比例發酵生物飼料，其產物中活菌數的結果見圖１。

從圖１ 可以看出，植物乳桿菌和酵母菌以１︰１的比例混合發酵時，產物中兩種菌的活菌數最高，酵母菌為10×10⁸ ｃｆｕ／ｇ，植物乳桿菌的活菌數為１７.４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。植物乳桿菌與酵母菌復合發

酵，酵母菌為兼性厭氧菌，植物乳桿菌為厭氧菌，發酵剛開始時酵母菌利用發酵底物中的氧氣快速生長；當氧氣消耗完后植物乳桿菌大量繁殖，產生的大量乳酸使發酵底物中的ｐＨ 值下降，酵母菌的生長受到限制。所以，這兩種菌同時發酵后產物中的植物乳桿菌的活菌數比酵母菌的高。

２.２　裝料量的優化

不同裝料量對發酵產物中兩種菌的活菌數的影響見圖２。

由圖２可以看出，在２５０ｍｌ的錐形瓶中，裝料量為５０ｇ時，產物中植物乳桿菌的活菌數最高，達１５.８×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。裝料量為４０ｇ時，酵母菌的活菌數最高，達９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ；但植物乳桿菌的活菌數是所有組中最低的。在５０、４０ｇ裝料量條件下產物中酵母菌的活菌數分別為７.２×１０⁸ 和９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。

綜合兩種菌的生長情況，得出最優裝料量為５０ｇ。裝料量直接影響了發酵底物的厚度。底物厚度小，菌體與空氣充分接觸，適合酵母菌的生長；底物厚度大，底部的菌體很難與空氣接觸，氧氣少，適合植物乳桿菌生長。

２.３　發酵底物水分含量的優化

微生物在發酵過程中需要有適宜的水分。發酵底物環境中的水分直接影響微生物的生長情況。發酵底物中不同的水分含量對發酵產物中活菌數的影響見圖３。

從圖３可以看出，發酵底物水分為５０％時，發酵產物中植物乳桿菌的活菌數最高，達１７.３×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。發酵底物中水分為４５％和５０％時，酵母菌的活菌數分別為１４.３ × １０⁸ 、１４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，與其他各組相比均達到較高水平。綜合兩種菌的生長情況，得出發酵底物中的水分為５０％時最優。

２.４　發酵溫度的優化

發酵溫度對發酵產物中活菌數的影響見圖４。

從圖４可以看出，發酵溫度為３４、３８和４２℃時，植物乳桿菌的活菌數較高，但酵母菌的生長受到抑制；相反，在較低溫度２６℃時酵母菌的生長優于植物乳桿菌。綜合考慮兩種菌生長的情況，在３４℃時植物乳桿菌數量最高，達到１８.２×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，酵母菌也達到最高水平１１.４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ。因此，選擇３４℃為最佳發酵溫度。溫度是影響微生物生長和存活的關鍵因素，微生物在最適的溫度條件下才能生長得最好。溫度過高會使微生物菌體中的蛋白質變性或受到不同程度的破壞，降低微生物的繁殖速度；溫度過低又抑制了酶的活性，蛋白質的合成速度受到限制，也影響微生物的生長繁殖。

２.５　發酵菌種接種量的優化

植物乳桿菌和酵母菌的接種量對發酵產物中活菌數的影響見圖５。

從圖５中可以看出，接種量為１０％ 時，發酵產物中植物乳桿菌和酵母菌的活菌數都達到最高，分別為１７.１×１０⁸ 和１４.０×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ 。接種量為１４％組和１０％組的植物乳桿菌數活菌數相差不大，但酵母菌數１４％組明顯低于其他各組。因此，綜合考慮兩種菌的生長情況，且為了降低生產成本，選擇最優接種量為１０％。

２.６　腐植酸鈉添加量的優化

腐植酸鈉不同添加量對發酵產物中活菌數的影響見圖６。

從圖６可以看出，腐植酸鈉添加量為２％ 時，發酵產物中的植物乳桿菌和酵母菌的活菌數含量最高，分別為１７.５９×１０⁸ 和８.８４×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，均高于腐植酸鈉０％組。添加４％、６％和８％的腐植酸鈉組，發酵產物中兩種菌的活菌數均低于０％組。說明腐植酸鈉含量過高可能抑制了這兩種菌的生長。

由此可見，腐植酸鈉的添加量對微生物的生長影響很大，本試驗腐植酸鈉最適合的添加量為２％。腐植酸鈉對細菌、酵母菌及放線菌有刺激生長、促進繁殖、加速新陳代謝的作用。腐植酸作為增效劑在釀酒工業上能促進酵母細胞的繁殖，提高酒母的生產能力，說明添加一定量的腐植酸鈉可以促進微生物的生長。

（１）玉米皮、棉籽粕、玉米粉、麩皮、稻殼和糖蜜等發酵原料確定后，菌種的比例、裝料量、發酵底物水分含量、發酵溫度、接種量和腐植酸鈉添加量等發酵條件的優化是提高產物中益生菌數的重要因素。

（２）本試驗得出復合菌生物飼料的最佳發酵工藝條件為：植物乳桿菌和酵母菌的接種比例為１︰１，裝料量５０ｇ，發酵底物含水量５０％，發酵溫度３４℃，接種量１０％，腐植酸鈉添加量２％。在此條件下的復合菌生物飼料中含有植物乳桿菌１７.５９×１０⁸ ｃｆｕ／ｇ，酵母菌８.８４×１０⁸ ｃｆ／ｇ。