1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地進(jìn)行。試驗(yàn)前沖洗試驗(yàn)場(chǎng)地，并全面消毒、密閉熏蒸（甲醛：高錳酸鉀=2：1）。仔豬自由采食和飲水，其他管理按照試驗(yàn)基地規(guī)定進(jìn)行。每天記錄豬的精神狀態(tài)、腹瀉狀況和采食量。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長(zhǎng)性能

于試驗(yàn)第1天和第22天早上對(duì)經(jīng)空腹處理的試驗(yàn)仔豬稱重，計(jì)算ADG；每日記錄采食量，用以計(jì)算平均日采食量（ADFI），并根據(jù)采食量和增重計(jì)算F/G。腹瀉率：每天早晚喂料期間仔細(xì)觀察糞便情況，并對(duì)每個(gè)重復(fù)的腹瀉頭次和評(píng)分進(jìn)行詳細(xì)的記錄。當(dāng)腹瀉評(píng)分大于或等于2時(shí)，判定該仔豬發(fā)生腹瀉，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。腹瀉率計(jì)算參照廖波等。計(jì)算公式如下：

腹瀉率=［腹瀉仔豬頭數(shù)/（仔豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）］×100。

1.5.2 養(yǎng)分消化率

飼糧樣品采用四分法收集，每個(gè)組取500g左右，發(fā)酵飼糧每日取約100g裝入樣品袋并記號(hào)，-20℃保存。試驗(yàn)結(jié)束后，將每日的發(fā)酵飼糧混合均勻，用于測(cè)定總能（GE）以及干物質(zhì)（DM）、粗灰分、CP、粗脂肪（EE）和總磷（TP）的含量。糞便采用全收糞法，以重復(fù)為單位，收集每個(gè)重復(fù)試驗(yàn)第18～21天排出的全部糞便，每次收集的糞便稱重后，按每100g加10%硫酸（H2SO4）10mL進(jìn)行固氮處理滴加數(shù)滴甲苯防腐，混勻糞樣，-20℃保存。試驗(yàn)結(jié)束后，將每個(gè)重復(fù)的所有糞樣攪拌混合均勻后，置于65℃烘箱干燥，粉碎，待測(cè)。飼糧和糞便中養(yǎng)分含量測(cè)定參照張麗英的方法。養(yǎng)分消化率以鹽酸不溶灰分為指示劑（測(cè)定方法參照GB/T 23742-2009）進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下：

某養(yǎng)分消化率（%）=（1-（A1×F2）/（A2×F1））×100。

式中：F1和F2分別代表飼糧和糞便中該養(yǎng)分含量（%）；A1和A2分別代表飼糧和糞便中鹽酸不溶灰分含量（%）。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

試驗(yàn)第22天，仔豬空腹稱重后，用真空采血管于前腔靜脈采血，室溫下靜止放置30min，然后3500r/min離心10min分離血清，-20℃保存，待測(cè)血清指標(biāo)。血清中總蛋白（TPROT）、尿素氮（UREA）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）含量和堿性磷酸酶（ALP）活性均采用試劑盒（瑞士羅氏公司）由全自動(dòng)血清生化儀（HITACHI，日本）測(cè)定。血清二胺氧化酶（DAO）活性采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（北京誠(chéng)林生物科技有限公司），按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 空腸黏膜消化酶活性

測(cè)定之前腸道黏膜樣品進(jìn)行勻漿，稱取一定量（0.3～0.5g）的黏膜樣品，按質(zhì)量體積比1：9（g/mL）加入生理鹽水，進(jìn)行超聲粉碎勻漿，3500r/min離心10min，取上清液，制成10%勻漿液，-20℃保存待測(cè)。空腸黏膜蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶和淀粉酶活性采用試劑盒（南京建成生物工程研究所），按照說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.5.5 小腸形態(tài)和杯狀細(xì)胞

用4%多聚甲醛將腸道組織固定，然后經(jīng)脫水、包埋、切片和染色等標(biāo)準(zhǔn)操作程序處理后，用光學(xué)顯微鏡鏡檢并拍照，每個(gè)樣品選取10個(gè)走向平直且形態(tài)完整的絨毛和隱窩進(jìn)行測(cè)定，并取相應(yīng)絨毛上的杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)。測(cè)定參照廖波等的方法。

1.5.6 腸道屏障相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定空腸和回腸閉合小環(huán)蛋白-1（ZO-1）、閉合小環(huán)蛋白-2（ZO-2）、黏蛋白2（MUC2）、密閉蛋白（OCLN）和封閉蛋白-1（CLDN-1）mRNA相對(duì)表達(dá)量。總RNA的提取按照試劑盒（TrizolReagent，TaKaRa，日本）操作說明進(jìn)行，RNA質(zhì)量檢測(cè)使用核酸蛋白檢測(cè)儀（BeckmanDU-800，CA，美國(guó)）于260nm檢測(cè)，A260/A280表示RNA的純度，該比值在1.8～ 2.0說明RNA純度較好。cDNA的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM Regent Kit，TaKaRa，日本），反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存待用。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）搜索基因序列，運(yùn)用Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表3。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7900HT real-time PCR System，ABI，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)熒光染料為SYBR Green I（TaKaRa，日本）。反應(yīng)體系為10.0μL：5.0μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、0.5μL 上游引物、0.5μL下游引物、3.0μL雙蒸水和1.0μL cDNA模板。選擇β-肌動(dòng)蛋白作為空腸和回腸黏膜的內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行初步整理與計(jì)算，然后用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，并結(jié)合Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值和集合標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵飼糧對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

如表4所示，與CON組相比，12hFER組和24hFER組組仔豬ADG均顯著提高（P<0.05），腹瀉率和F/G顯著降低（P

2.2 發(fā)酵飼糧對(duì)仔豬養(yǎng)分消化率的影響

如圖1所示，與CON組和AB組相比，12h FER組和24hFER組DM、CP、EE、Ash、GE和TP的消化率均顯著提高（P

2.3 發(fā)酵飼糧對(duì)仔豬血清生化指標(biāo)的影響

如表5所示，與CON組相比，24hFER組仔豬血清中DAO活性顯著降低（P

2.4 發(fā)酵飼糧對(duì)仔豬空腸黏膜消化酶活性的影響

如表6所示，與CON組相比，AB組和24h FER組仔豬空腸蔗糖酶活性均顯著提高（P<0.05）；與12h FER組相比，24hFER組仔豬空腸蔗糖酶活性顯著提高（P

2.5 發(fā)酵飼糧對(duì)仔豬小腸形態(tài)和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

如表7所示，在十二指腸中，與CON組相比，12hFER組和24h FER組仔豬絨毛高度/隱窩深度（絨隱比）顯著提高（P<0.05），12hFER組仔豬隱窩深度顯著降低（P<0.05）；與AB組相比，12hFER組仔豬絨隱比顯著提高（P<0.05），隱窩深度顯著降低（P<0.05）。在空腸中，與CON組相比，24hFER組仔豬隱窩深度顯著降低（P<0.05），12h FER組仔豬空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P<0.05）；與AB組相比，12hFER 組仔豬空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P<0.05）。在回腸中，與CON組和AB組相比，12h FER 組和24h FER組仔豬空腸絨毛高度顯著提高（P

2.6 發(fā)酵飼糧對(duì)仔豬空腸和回腸緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖2所示，在空腸中，24hFER組仔豬空腸CLDN-1和ZO-1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他3組（P<0.05）。在回腸中，與CON組和AB組相比，12hFER組和24hFER組仔豬OCLN基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05）

3 討論

研究表明，飼料經(jīng)發(fā)酵或者添加酶制劑均可以緩解仔豬腹瀉，提高飼料利用率，改善仔豬生長(zhǎng)性能。Chang等研究指出，乳酸菌發(fā)酵飼糧能顯著提高仔豬ADG和養(yǎng)分消化率。Wang等在飼糧中添加24%發(fā)酵豆粕，結(jié)果顯示，發(fā)酵豆粕顯著提高了仔豬ADG，同時(shí)降低了F/G。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，2組菌酶協(xié)同發(fā)酵飼糧均能顯著提高仔豬ADG，顯著降低F/G，并有效緩解仔豬腹瀉，其腹瀉率分別降至6.55%和8.53%，與上述研究結(jié)果相似。這可能是由于菌酶協(xié)同發(fā)酵飼糧中含有大量有活性的乳酸菌，一方面，乳酸菌的增殖可產(chǎn)生大量的乳酸，降低飼糧pH，從而使易引起仔豬腹瀉的大腸桿菌數(shù)量大幅減少，仔豬腹瀉率降低，從而減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，菌酶協(xié)同發(fā)酵提高了飼糧的可消化性，菌酶協(xié)同發(fā)酵兼具發(fā)酵和酶解的功能，不僅能縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵效率，還能有效提高飼料的酶解程度，經(jīng)酶解后的飼糧更易于被仔豬的消化和吸收。此外，各試驗(yàn)組仔豬ADFI無顯著差異，但2個(gè)發(fā)酵組ADFI比對(duì)照組高50～70g/d。分析其原因，可能有以下2點(diǎn)：1）飼料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸使飼糧具有酸香味，且適口性有所增強(qiáng)，從而促進(jìn)動(dòng)物的采食；2）仔豬采食發(fā)酵飼糧時(shí)，大量益生菌隨之進(jìn)入仔豬腸道內(nèi)，有益菌群在腸道內(nèi)定植后利用微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，幫助機(jī)體分解食物并促進(jìn)消化吸收，有利于促進(jìn)仔豬采食。動(dòng)物的生長(zhǎng)性能與消化性能密切相關(guān)，即動(dòng)物對(duì)飼糧中的養(yǎng)分消化率越高，其生長(zhǎng)性能越好。本試驗(yàn)中，12h FER組和24h FER組DM、CP、EE、Ash、GE和TP消化率顯著提高，這說明12和24h發(fā)酵可提高仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，進(jìn)而改善仔豬生長(zhǎng)性能。

血清中ALB、TPROT含量能夠反映機(jī)體的新陳代謝功能，血清中DAO活性是反映腸道功能的重要指標(biāo)之一。其中ALB合成于肝臟，具有清除自由基、抗凝血等生理功能。本研究的結(jié)果顯示，24hFER組仔豬血清DAO活性顯著低于其他組，2個(gè)發(fā)酵組血清ALB含量與CON組相比有提高的趨勢(shì)，表明24hFER組仔豬的腸道功能得以增強(qiáng)，同時(shí)，12h FER組和24hFER組仔豬的代謝狀況可在一定程度上改善。

空腸內(nèi)含有大量消化酶，如淀粉酶、蔗糖酶等，是仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化和吸收的重要場(chǎng)所。消化酶的活性可受多種因素影響，如飼糧的種類、外源性激素、抗?fàn)I養(yǎng)因子和動(dòng)物的年齡等。馮尚連等研究表明，乳酸可以提高仔豬空腸二糖酶活性。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，24hFER組仔豬空腸蔗糖酶活性顯著高于對(duì)照組，12h FER組蔗糖酶活性比對(duì)照組高39.04%。所以，可能是發(fā)酵飼糧中乳酸提高了蔗糖酶的活性。

小腸的絨毛高度和隱窩深度及絨隱比是反映腸道通透性、吸收性和腸道黏膜功能是否完善的重要指標(biāo)。 魏小兵等研究表明，無抗發(fā)酵飼糧組仔豬空腸和回腸絨毛高度顯著升高，隱窩深度降低，絨隱比顯著提高，杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加。張俊等在肉雞上的研究也得到相似的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與CON組相比，12h FER組仔豬十二指腸隱窩深度顯著降低，十二指腸絨隱比和回腸絨毛高度顯著提高，空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加，與前人研究結(jié)果基本一致。這表明本試驗(yàn)所采用的菌酶協(xié)同發(fā)酵飼糧能夠促進(jìn)仔豬小腸的生長(zhǎng)發(fā)育，改善仔豬腸道組織形態(tài)，保障腸道黏膜的完整性，這與生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分消化率的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，說明12和24h發(fā)酵可能是通過促進(jìn)腸道組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育來促進(jìn)仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與利用，進(jìn)而促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。

有研究指出，腸道上皮細(xì)胞是腸道機(jī)械屏障發(fā)揮功能的關(guān)鍵。OCLN、CLDN-1、ZO-1、ZO-2等緊密連接蛋白是連接腸上皮細(xì)胞的重要組分。研究發(fā)現(xiàn)，OCLN和CLDN-1可以通過影響緊密連接，影響上皮細(xì)胞的通透性及腸道屏障功能。Woo等研究了發(fā)酵大麥和豆粕混合飼糧對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）致炎的小鼠腸道屏障功能的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵大麥和豆粕混合物顯著上調(diào)了小鼠結(jié)腸中OCLN、CLDN-1和ZO-1的基因表達(dá)量。張俊等的研究結(jié)果表明，益生菌發(fā)酵飼糧可以顯著提高肉雞回腸中封閉蛋白-3（CLDN-3）和ZO-1基因的表達(dá)量。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，24h FER組仔豬空腸黏膜CLDN-1和ZO-1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，12hFER組和24h FER組仔豬回腸OCLN基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，與小腸組織形態(tài)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，說明飼喂12和24h發(fā)酵飼糧能提高仔豬腸道絨毛高度和絨隱比，上調(diào)CLDN-1、ZO-1和CLDN基因的表達(dá)，維持小腸組織的完整性和選擇通透性，增強(qiáng)腸道的機(jī)械屏障功能。腸道黏膜表面覆蓋有黏液，黏液層是腸道內(nèi)共生菌的主要棲息場(chǎng)所，是腸道重要的化學(xué)屏障，具有保護(hù)腸道，使其免受機(jī)械損傷的作用。杯狀細(xì)胞可分泌黏蛋白，對(duì)維持腸道黏膜健康起重要作用。有研究表明，乳酸菌可通過調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞影響腸道的屏障功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，12h發(fā)酵飼糧可顯著提高空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量，回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量提高46.53%，與前人研究結(jié)果一致。所以，可能是發(fā)酵飼糧中乳酸菌促進(jìn)了杯狀細(xì)胞的增殖。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，發(fā)酵飼糧可改善腸道健康，提高養(yǎng)分消化率，降低腹瀉率，從而提高仔豬生長(zhǎng)性能，發(fā)酵飼量效果相當(dāng)于或優(yōu)于金霉素，發(fā)酵12與24h飼糧效果相當(dāng)。

生物發(fā)酵飼料的制作方法

生物發(fā)酵飼料不是什么高大上的東西，只要有專業(yè)的飼料發(fā)酵劑+原料就可以自己制作。所需的材料和設(shè)備都要求不高，具體做法是：

1.按照配方分別稱取原料（參考配方1：玉米50%、豆粕或菜粕50%；參考配方2：60%全價(jià)配合飼料、豆粕40%；參考配方3:100%的豬雞鴨全價(jià)飼料。配方中蛋白飼料越多效果越好。

2.選用含復(fù)合菌+復(fù)合酶制劑組合的酶菌結(jié)合飼料發(fā)酵劑，特別推薦選用“99多功能飼料發(fā)酵劑”這個(gè)發(fā)酵劑，500克/包，市場(chǎng)售價(jià)僅25元，發(fā)酵1-2噸飼料，使用量越大效果越好，菌種品種和數(shù)量多，且含豐富酶制劑分解飼料中的粗纖維效果好，且發(fā)酵完成的飼料香甜味和適口性更好。

3.將菌種溶于溫水中半小時(shí)以上，加入少量紅糖或糖蜜效果更好，然后均勻噴灑在發(fā)酵料中，邊拌邊灑，使發(fā)酵料的含水量達(dá)到手捏成團(tuán)、落地即散的程度，一般料含水量55%-60%比較好。

4.將拌好的發(fā)酵飼料裝于塑料桶或陶瓷缸中或水泥池內(nèi)，稍將料壓實(shí)后密封讓其自然發(fā)酵。一般氣溫在25℃以下時(shí)，發(fā)酵時(shí)間為7--10天，氣溫在25℃以上時(shí)，則為3--5天。

5.發(fā)酵后，pH值達(dá)到4--5以下，并有濃郁的酒香味，即為發(fā)酵成功。

發(fā)酵飼料制作現(xiàn)場(chǎng)

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