摘要：

本試驗旨在通過體外發酵法研究棉籽酶解蛋白對奶牛瘤胃發酵及瘤胃微生物區系的影響。選用體況、泌乳天數相近的4頭荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，采用單因子試驗設計，將采集的瘤胃液均勻混合后隨機分為4組，即對照組(C組)、低濃度組(E組)、中濃度組(F組)和高濃度組(G組)，分別添加0(對照)、0.3%、0.5%和0.7%棉籽酶解蛋白(干物質基拙)。培養2、4、6、8、12、24、48 h后測定瘤胃發酵參數和瘤胃微生物數量。

結果表明：1)與對照組相比，培養2~8 h，各組pH顯著降低(P<0.05)，但均處于正常范圍之內；在整個培養過程中，各組氨態氮(NH3-N)濃度顯著降低，菌體蛋白(MCP)濃度顯著升高(P<0.05)；C組和G組的總揮發性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸濃度均顯著高于E組和F組(P<0.05 )，而E組和F組的乙酸/丙酸顯著低于C組和G組(P<0.05 )。

2)與對照組相比，各時間點F組白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌數量顯著增加(P<0.05 )。在整個培養過程中，G組反芻獸新月形單胞菌數量顯著低于其他組(P<0.05)，F組布氏普雷沃氏菌數量顯著高于其他組(P<0.05 )。培養2~6h，F組反芻獸新月形單胞菌數量顯著高于對照組(P<0.05 )。綜上所述，棉籽酶解蛋白的添加可改善瘤胃發酵模式，顯著提高瘤胃纖維分解菌數量。在本試驗條件下，棉籽酶解蛋白的最適添加劑量為0.5%。

引言：

瘤胃微生物以及瘤胃內環境的穩態在反芻動物對飼糧營養物質的消化過程中起著重要作用。飼糧中的蛋白質進入奶牛瘤胃后，70%能夠被微生物所消化，其余30%進入真胃和小腸等部位進行消化。大部分飼糧中蛋白質被瘤胃微生物轉化為微生物蛋白，其品質較優質蛋白質差，使飼糧中優質蛋白質的利用率降低。在奶牛飼糧中添加非蛋白氮會為瘤胃微生物合成微生物蛋白提供氮源，從而能夠提高過瘤胃蛋白含量，有利于優質蛋白質在小腸段被消化吸收，進而提高其利用率。但是，非蛋白氮的使用需要注意諸多問題，如需添加能量飼料、配合粗蛋白質使用和防止氨中毒等。因此，探尋安全、有效的新型飼料添加劑有利于奶牛對飼糧中優質蛋白質的吸收利用，提高飼料轉化率，改善乳品質。

小肽(SP)通常是指由2~3個氨基酸組成的寡肽，具有轉運速度快、耗能低和不易飽和等特點，比單一氨基酸更容易被機體組織吸收和利用。因為小肽可被反芻動物機體完全吸收，對反芻動物自身的蛋白質營養具有重要意義，所以，小肽在反芻動物生產中的應用逐漸增多。棉籽酶解蛋白是以優質的植物蛋白質為原料，經組合液態酶酶解工藝生產的小肽產品，該產品對奶牛瘤胃發酵有無影響還需進一步研究。因此，本試驗主要通過體外批次培養法，旨在研究棉籽酶解蛋白對奶牛瘤胃發酵和微生物區系的影響，為該產品作為飼料添加劑在奶牛養殖中的進一步應用提供科學依據。

材料與方法：

1.試驗材料

試驗所用棉籽酶解蛋白是通過植物蛋白酶解得到的功能肽產品，總蛋白質含量在45%以上，其中小肽含量為28%(谷氨酸含量9.55%、天冬氨酸含量4.20%、精氨酸含量4.47%、賴氨酸含量2.86%、亮氨酸含量2.76%、甘氨酸含量2.27%和苯丙氨酸含量2.27% )，由成都某公司提供。

2、試驗設計

    選取4頭健康、體況和泌乳天數相近的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，每天07:00和18:00飼喂和擠奶，飼糧精粗(干物質基礎)比為50:50。體外發酵底物與供體奶牛飼糧水平相同，粉碎后過1mm篩。本試驗采用單因素隨機試驗設計，將采集的瘤胃液混勻后分為4組，即對照組(C組)、低濃度組(E組)、中濃度組(F組)和高濃度組(G組)，并分別在其底物中添加0、0.3%、0.5%和0.7%的棉籽酶解蛋白(干物質基礎)，每組每個時間點3個重復，體外發酵培養48h，分別在2、4、6、8、12、24和48 h進行樣品采集，每次3個重復全部采集瘤胃上清液。

3.體外發酵培養與樣品采集

    采用瓶口向上且蓋有橡膠塞的250mL玻璃瓶作為人工瘤胃培養瓶。試驗前，將精確稱取的2g基礎培養底物放入人工瘤胃培養瓶中，C組、E組、F組和G組分別加入0、6、10和14mg棉籽酶解蛋白。參照Menke等的體外培養方法，將過濾后的瘤胃液與配制好的緩沖液按照1:2的比例混勻于持續通入二氧化碳的三角瓶中，制成人工瘤胃培養液，三角瓶置于39℃水浴中。抽取200mL人工瘤胃培養液分裝于預熱至39℃并通有二氧化碳的培養瓶中，蓋緊瓶塞，放入39℃水浴搖床上開始厭氧培養。將玻璃瓶的2/3浸于控溫水浴搖床中，搖床頻率為40 r/min。試驗過程中，每30 min進行1次排氣，培養時間48h。

    在體外發酵培養過程中，分別在2、4、6、8、12、24和48 h取出3瓶，停止發酵。取出的樣品使用EL20型酸度計測定培養液pH后，分為3部分：一部分取5mL瘤胃液裝在含有2mL25%偏磷酸的10mL離心管中，-20℃保存，用于測定瘤胃液揮發性脂肪酸(VFA)濃度；一部分放到10mL離心管中，-20℃保存，用于測定瘤胃液中氨態氮(NH3-N)和菌體蛋白(MCP)濃度；一部分裝在50mL離心管中，-80℃保存，用于后期瘤胃微生物DNA的提取和測定。

結果:

1.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液pH的影響

由表1可知，在整個培養過程中，瘤胃發酵液pH均處于正常水平之中。在體外培養的8h以內，各組的pH均顯著低于對照組(P

2.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液NH3-N濃度的影響

由表2可知，隨著培養時間的增加，各組NH3-N濃度均呈現先下降后上升的趨勢。當培養8h后，各試驗組瘤胃發酵液中NH3-N濃度明顯上升，24~48 h則趨于平緩。在培養2~12 h，各組瘤胃發酵液中NH3-N濃度均顯著低于對照組(P<0.05 )；在培養24和48 h時，F組瘤胃發酵液中NH3-N濃度均顯著高于其他3組(P<0.05 )。除在2 h，F組和G組之間差異不顯著(P>0.05)外，其余各時間段各組之間NH3-N濃度均呈差異顯著(P<0.05)。

3.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液MCP濃度的影響

由表3可知，在整個培養過程中，各組瘤胃液中MCP濃度均呈先上升再下降，再上升，再下降的趨勢；在培養2~8h，對照組MCP濃度呈上升狀態，之后趨于平緩。在各時間點，與對照組相比，各試驗組瘤胃發酵液中MCP濃度顯著升高(P<0.05 )；除2、12和24h外，G組在各時間點瘤胃發酵液中MCP濃度顯著高于其他組(P<0.05 )。

4.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液VFA濃度的影響

由表4可知，在整個培養過程中，各試驗組總揮發性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸濃度和乙酸/丙酸均呈先急劇上升，后緩慢上升趨勢。各試驗組之間TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度在各時間段內均呈差異顯著(P<0.05)；其中，C組和G組的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸濃度均在較高水平波動，顯著高于E組和F組(P<0.05 )；各時間點的E組和F組乙酸/丙酸總體上顯著低于對照組和G組(P<0.05)。

5.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液普雷沃氏菌數量的影響

由表5可知，在整個培養過程中，布氏普雷沃氏菌數量呈平緩式下降，易北普雷沃氏菌數量呈波動式下降；F組布氏普雷沃氏菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)，E組布氏普雷沃氏菌數量顯著低于對照組(P<0.05)；G組布氏普雷沃氏菌數量在2~12h培養過程中顯著低于對照組(P<0.05)。在培養2h時，F組易北普雷沃氏菌數量顯著高于其他3組(P<0.05 )，而E組易北普雷沃氏菌數量顯著低于對照組和G組(P<0.05 )；在培養8h時，G組易北普雷沃氏菌數量顯著低于其他3組(P<0.05 ) ；在培養24 h時，E組易北普雷沃氏菌數量顯著低于其他3組(P<0.05 )；在培養48 h時，F組和G組易北普雷沃氏菌數量顯著高于對照組和E組(P<0.05)。

6.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液反芻獸新月形單胞菌數量的影響

由表6可知，在整個培養過程中，各試驗組反芻獸新月形單胞菌數量的變化趨勢相似，在培養2~4h呈下降趨勢，在4~6h急劇上升，之后趨于平緩趨勢。在培養2~6h，F組反芻獸新月形單胞菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)；各時間點G組反芻獸新月形單胞菌數量顯著低于其他3組(P<0.05)。

7.棉籽酶解蛋白對體外瘤胃發酵液中瘤胃球菌數量的影響

由表7可知，在整個培養過程中，各試驗組的黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌數量變化趨勢大體相同；黃色瘤胃球菌數量呈先增加后降低趨勢，白色瘤胃球菌數量呈平緩上升趨勢。各個時間點F組的黃色瘤胃球菌數量和白色瘤胃球菌數量顯著高于其他3組(P<0.05)。

結論：

①添加棉籽酶解蛋白能夠在合理的范圍內降低瘤胃液pH和NH3-N的濃度，增加MCP濃度，促進瘤胃發酵，但對VFA的產生有一定抑制作用。

②添加棉籽酶解蛋白能夠增加 瘤胃球菌的數量，促進瘤胃微生物對纖維的降解能力。同時，棉籽酶解蛋白會減少瘤胃中普雷沃氏菌的數量，有可能會抑制瘤胃微生物對蛋白質的降解。通過瘤胃發酵參數和微生物數量綜合比較各組結果，棉籽酶解蛋白的最適添加劑量為0.5%。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣，蛋白質含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質，這些物質含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術，可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料，直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅（發酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物，在發酵過程中分泌的代謝產物，可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時，應結合菜粕的氨基酸組成特點，適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術，具體操作如下：

1.仔細檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分，輕度發霉的原料可以忽略，因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響，通常夏季發酵2-3天，冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后，有較為強烈的酸香味，ph值在3-4。

規模運用混合發酵現場

塑料缸、飼料袋（有內膜）均可做發酵飼料

采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。 

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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