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1.1 菌種與培養基

發酵菌種:本試驗所用菌種均為購買或獲贈于其他實驗室，共12株，包含曲霉菌3株，木霉菌2株，枯草芽孢桿菌4 株，酵母菌3 株。菌種保存在4 ℃冰箱，每3 個月活化1 次。

發酵培養基:甘薯渣和菜籽粕按9∶ 1 混勻，30 g裝入250 mL 廣口瓶，121℃滅菌20 min。甘薯渣購于綿陽一淀粉加工廠，為提取淀粉后的殘渣，粗蛋白質含量為1.76% ，粗纖維含量為8.80% ;菜籽粕購于四川省雅安市農牧市場，粗蛋白質含量為36.93% ，粗纖維含量為12. 27%。

1.2 最適單菌種的篩選及菌種復配篩選

采用單因子試驗設計，4 類共12 株菌種分別接種于甘薯渣發酵培養基進行單菌發酵。發酵條件為接種量1 × 10⁶ 個/g，加水60% ，溫度30 ℃，發酵4d，pH 自然，每株菌重復3 次，以未添加菌液的空白發酵組為對照。考察發酵前后粗蛋白質含量、羧甲基纖維素酶( carboxymethyl cellulose，CMCase) 活性和還原糖含量變化，從曲霉類、木霉類、芽孢桿菌類、酵母類菌株中，各篩選1 株最適發酵菌種，并以篩選出的4 株菌中發酵效果最好的菌種作為主菌種(A) ，分別和其他的3 株輔發酵菌種(B、C、D) 進行雙菌、三菌和四菌混菌復配篩選。各菌種的接種比例為1∶ 1 (1∶ 1∶ 1、1∶ 1∶ 1∶1) ，每組均設3 個重復。發酵條件參考主發酵菌單因素發酵優化試驗結果:接種量1 × 10⁶ 個/g，發酵時間4 d，料水比(m/V) 1∶ 1. 3，培養溫度38 ℃。最終以粗蛋白質含量為主要指標，CMCase 活性和還原糖為輔助指標，確定最優的菌種組合。

1.3 正交試驗優發混菌發酵條件

采用正交設計進一步對發酵溫度( A)、發酵時間(B)、料水比(C)、接種量(D)、菌種復配比例(E) 進行5 因素4 水平的發酵條件優化( n = 3)。其中接種量、發酵時間、料水比、發酵溫度水平設置參考主發酵菌單因素發酵條件優化試驗結果。發酵結束后，取部分鮮樣測定CMCase 活性，剩余部分65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，用于測定粗蛋白質和還原糖含量。

1.4 最優發酵條件發酵對甘薯渣營養價值的影響

根據正交試驗設計優化出的混菌發酵參數，對甘薯渣進行固態發酵，設置1 個對照組( 不接種菌種)，其他條件與試驗組一致。每組設3 個重復。發酵結束后，取部分鮮樣測定CMCase、濾紙酶( filterpaper，FPA)、β－葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、淀粉酶活性，剩余部分65 ℃烘干，粉碎過40 目篩，用于測定干物質、粗灰分、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白質、還原糖含量。

1.5 指標測定

還原糖含量測定參照黃曉鈺等《食品化學綜合實驗》;水分、粗脂肪、粗蛋白質、粗灰分、粗纖維含量的測定參照張麗英《飼料分析及飼料質量檢測技術》; 纖維素酶活性參照國標GB /T23881—2009、何鳳琴等及湯小朋等的測定方法;淀粉酶活性參照陳毓荃主編的《生物化學實驗方法和技術》中介紹的淀粉酶活性的測定方法。

1.6 數據分析

數據先用Excel 2003 進行整理，再用SPSS21. 0 處理、分析。單因素篩選試驗數據進行單因素方差分析并結合Duncan 氏法進行多重比較;正交試驗數據進行極差分析及方差分析。所有試驗結果均用平均值±標準差表示，顯著水平為P ＜0.05。

2.1 最適單菌種發酵的篩選

12 種單菌種發酵甘薯渣后，粗蛋白質含量、CMCase 活性、還原糖含量見表1。從表中可以看出，黑曲霉2 發酵甘薯渣后其粗蛋白質含量從5.64%提高到7.89% ，提高了44.7% ，顯著高于其他菌種發酵組(P＜0.05) ;黑曲霉2發酵組所產的CMCase 活性為2.61 U /g，顯著高于其他單菌發酵組(P＜0.05)。綜合考慮粗蛋白質含量、CMCase活性和還原糖含量等指標，確定黑曲霉2為曲霉組中優勢菌種，同時也是12種菌株中最優發酵菌種，將其定為本試驗主發酵菌種，記作A。

不同的微生物產酶的種類和產酶能力不同，需要根據發酵目的不同來選擇不同的微生物進行發酵。本研究一共對4類共12種菌株進行發酵篩選，結果發現曲霉中的黑曲霉2，木霉中的里氏木霉，芽孢桿菌枯草芽孢桿菌1，酵母中的釀酒酵母1效果較好。其中黑曲霉能產生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、葡萄糖酶、植酸酶、半乳甘露聚糖酶等酶類，因此在發酵中得到廣泛的應用，但黑曲霉因變異性大，不同的黑曲霉菌株，發酵效果不一樣。木霉也廣泛用于微生物發酵，資料報道里氏木霉能分泌大量的纖維素酶和木聚糖酶。芽孢桿菌作為益生菌，可促進動物對飼料的消化、吸收、利用，從而提高飼料的轉化率，并在防病促生長中起到非常重要作用。酵母屬于益生菌，在發酵中應用廣泛，發酵過程中酵母自身的繁殖生長會產生大量的高營養價值菌體蛋白。

以篩選出的黑曲霉2為主發酵菌，與篩選出的其他3種菌種進行不同復配，發現四菌組合發酵效果優于雙菌和三菌組合，發酵后甘薯渣粗蛋白質含量和CMCase酶活均高于其他組合(表2)。有研究報道，里氏木霉與黑曲霉混合發酵可彌補里氏木霉所產的β－葡萄糖苷酶活性較低的不足，提高酶解效率，讓基質充分發酵。Ahamed等對里氏木霉ＲUT－C30與黑曲霉LMA進行混合發酵，發現FPA可達到7.1U/mL，與單菌發酵的3.4U/mL相比提高了108.8%。本研究發現4菌混合發酵，效果優于其他發酵組合，可能原因在于多菌組合發揮了各個菌種相互之間的協同效應。

微生物接種量、發酵時間、發酵溫度、水分含量等因素也對發酵效果有著重要的影響。本研究利用L₁₆(4⁵)正交試驗設計考察了4菌混合發酵的最優發酵參數，試驗獲得的混菌發酵最適參數為:培養溫度38℃，培養時間4.5d，料水比1∶1.3，接種量1×10⁶個/g，接種比例1∶1∶2∶1。傅婭梅對復合蛋白質飼料適宜的發酵參數進行探討，發現最適參數為:發酵時間2.5d，加水量65%，接種量10%，枯草芽孢桿菌:產朊假絲酵母:植物乳酸桿菌為1∶1∶1;胡瑞等用復合益生菌發酵豆粕，發現在復合益生菌(釀酒酵母∶米曲霉∶枯草芽孢桿菌=5∶1∶2)總添加量0.5%，料水比1∶0.4，發酵48h小效果最佳。

陳松等利用產朊假絲酵母、白地霉、枯草芽孢桿菌和黑曲霉混菌發酵蘋果渣，發酵后基質粗蛋白質含量較發酵前提高了108%。王叔軍等向甘薯渣中添加少量的麩皮和尿素作為氮源，用微生物進行混菌發酵后，粗蛋白質含量提高到42.4%。趙啟美等采用固液結合的方法，發酵甘薯渣后，粗蛋白質含量提高了58.4%;粗纖維含量由25.3%下降到14.2%。本研究中，發酵后產物中粗蛋白質、粗脂肪和灰分含量顯著提高。但發酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所上升，可能原因在于甘薯渣在提取淀粉過程中，因淀粉提取程度不同，造成甘薯渣粗纖維含量差異很大，本研究中所用原料粗纖維只有8.8%，低于資料報道的27%的水平。因此發酵時微生物優先利用淀粉生長，這也是本研究中甘薯渣發酵后與湯小鵬等發酵木薯渣相比，本試驗中產物中淀粉酶活性高，而CMCase等纖維素降解酶活性相對較低的原因。多菌混菌固態發酵，可有效提高產物中FPA、CMCase和淀粉酶等活性，本研究采用4種不同菌株混菌發酵，產物中檢測出了FPA、CMCase、β－葡萄糖苷酶和淀粉酶等活性。微生物在發酵過程中，利用發酵底物提供的氮源和碳源進行繁殖、生長，消耗部分底物，導致底物干物質含量降低，從而使粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分含量相對提高，但是通過微生物發酵，一方面微生物可將甘薯渣中低質量蛋白質轉化為高質量菌體蛋白，提高蛋白質質量;另一方面固態發酵后產生的各種酶，以及微生物發酵過程中累積大量營養豐富的菌體蛋白及許多微生物代謝產物，間接提高了發酵產物營養價值，可望使甘薯渣營養價值得到進一步改善。此外，混菌發酵時有益微生物的競爭性生長，可望有效抑制導致甘薯渣腐爛變質的有害微生物如黑根霉(Rhizopus stolonifer)軟腐菌生長，提高甘薯渣的存儲價值。

①通過L₁₆(4⁵)正交試驗得到多菌混合發酵甘薯渣的最優條件為:發酵溫度38℃，發酵時間4.5d，料水比1∶1.3，接種量1×10⁶個/g，接種比例為黑曲霉2∶里氏木霉∶枯草芽孢桿菌1∶釀酒酵母1=1∶1∶2∶1。

②以最優條件混菌發酵甘薯渣后，發酵產物中可檢測到CMCase、FPA、β－葡萄糖苷酶和淀粉酶等酶活性。與對照相比，以干物質為基礎，發酵后顯著提高了產物中粗蛋白質、粗脂肪和還原糖含量。發酵后粗纖維含量沒有下降，反而有所上升。