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導(dǎo)讀

    鈷（Co）是銀白色鐵磁性金屬，在周期表中屬Ⅷ族，屬于鐵族元素，理化性質(zhì)與鐵、鎳接近，是動(dòng)物的一種必需微量礦物元素。維生素B₁₂因含Co又稱鈷胺素，其生物功能主要有促進(jìn)紅細(xì)胞成熟和發(fā)育、脂肪酸代謝、高半胱氨酸的甲基化、正常葉酸循環(huán)，維生素B₁₂缺乏常導(dǎo)致葉酸缺乏癥。已有研究證明，Co可以促進(jìn)動(dòng)物胃腸道微生物合成維生素B₁₂來(lái)維持魚類正常生長(zhǎng)的需要，從而彌補(bǔ)飼料中維生素B₁₂的不足 。另外，Co在增強(qiáng)血紅素的分解代謝、動(dòng)物抗氧化活性和抑制炎癥反應(yīng)上也有重要作用 。

    和陸生動(dòng)物不同，魚類可以從水體吸收部分礦物元素，但水體礦物元素含量往往不足，因此飼料中必須補(bǔ)充適量的礦物元素來(lái)滿足魚類生長(zhǎng)的需要。動(dòng)物缺Co會(huì)出現(xiàn)食欲減退、生長(zhǎng)受阻、血紅蛋白或紅細(xì)胞成熟因子合成不足等問(wèn)題。目前，有關(guān)Co的需要量、促生長(zhǎng)作用、與維生素B₁₂的關(guān)系等研究已在點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）、尖吻鱸（Lates calcarifer） 及胡子鯰（Clarias batrachus）、齊氏羅非魚（Tilapia zillii）、尼羅羅非魚（Oreochromus niloticus） 、南亞野鯪（Labeo rohita）、草魚（Ctenopharyngodon idella）上有所報(bào)道。生物學(xué)效價(jià)常用來(lái)評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)物被吸收、保留和利用的效率，不同來(lái)源的礦物元素具有不同的生物學(xué)效價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，羥基蛋氨酸錳在提高軍曹魚（Rachycentron canadum）生長(zhǎng)、抗氧化和脊椎骨礦物元素沉積方面比硫酸錳和甘氨酸錳效率更高；在提升鮑魚（Haliotis discushannai Ino）增重率或堿性磷酸酶活性方面，蛋氨酸鋅的生物學(xué)效價(jià)是硫酸鋅的3倍左右；以特定生長(zhǎng)率和全魚硒含量為判據(jù)，軍曹魚幼魚對(duì)蛋氨酸硒的生物學(xué)效價(jià)分別相當(dāng)于亞硒酸鈉的1.2和2.9倍 。然而，也有研究報(bào)道賴氨酸銅和硫酸銅在影響牛的生長(zhǎng)及血清銅藍(lán)蛋白活性及免疫方面沒(méi)有顯著差異。目前關(guān)于Co的研究大多涉及氯化鈷（Co-Cl）、碳酸鈷、氧化鈷、乙酸或丙酸鈷鹽等形式，尚未見(jiàn)軍曹魚Co需要量及蛋氨酸鈷（Co-Met）和Co-Cl生物學(xué)效價(jià)的比較研究。 

    軍曹魚隸屬鱸形目（Perciformes），軍曹魚科（Rachycentridae），軍曹魚屬，亦稱海鱺、海龍、海鯉、竹五等，為暖水性底層魚類，我國(guó)主要產(chǎn)于海南、廣東和臺(tái)灣等省。軍曹魚是大型肉食性魚類，生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，是市場(chǎng)上暢銷的水產(chǎn)品，現(xiàn)已是我國(guó)南方沿海海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要對(duì)象之一。目前有關(guān)軍曹魚蛋白質(zhì) 、脂肪、碳水化合物、維生素及礦物元素需要量以及魚粉替代等營(yíng)養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)問(wèn)題已有大量研究。本試驗(yàn)擬研究飼料中不同Co源和Co含量對(duì)軍曹魚幼魚營(yíng)養(yǎng)生理功能的影響，并比較2種Co源的生物學(xué)效價(jià)，旨在為確定軍曹魚幼魚Co需要量并為軍曹魚營(yíng)養(yǎng)參數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)的完善及高效配合飼料的研發(fā)積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)用Co-Cl為分析純，試驗(yàn)用Co-Met的Co含量為0.2％，蛋氨酸（Met）含量為1.7％，均購(gòu)自長(zhǎng)沙某公司。

1.2 試驗(yàn)飼料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    以脫維酪蛋白和魚粉為蛋白質(zhì)源，玉米淀粉為糖源，玉米油、魚油和大豆磷脂油為脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料（不添加維生素B₁₂）。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0（對(duì)照）、2、4、8、16、32mg/kg（以Co計(jì)）的Co-Cl和Co-Met，共配制出11種試驗(yàn)飼料（共用對(duì)照飼料）。飼料原料粉碎后過(guò)６０目篩，根據(jù)飼料配方稱取各原料，微量組分采用逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻后，加魚油、玉米油和大豆磷脂油攪拌均勻，再用V型立式混合機(jī)混合5min，然后加30％～40％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水，用F-26型雙螺桿擠壓機(jī)（華南理工大學(xué)，廣州）制成粒徑為3.0ｍｍ的顆粒飼料，在避光通風(fēng)處風(fēng)干至飼料水分含量為10％左右，封口袋封裝，-20℃冰箱冷凍保藏。通過(guò)電感耦合等離子體－質(zhì)譜儀（ICP-MS，Agilent7700x，Agilen Technologies，美國(guó)）測(cè)定飼料中Co的含量。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

    養(yǎng)殖試驗(yàn)在廣東省湛江市南三島海上浮式魚排中進(jìn)行，試驗(yàn)所用的軍曹魚幼魚購(gòu)買于廣東湛江市英利鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶。魚苗暫養(yǎng)2周，期間投喂商品飼料（粗蛋白質(zhì)含量≥55％，粗脂肪含量≥8％）。分組前停食24h，隨機(jī)挑選規(guī)格一致、健康無(wú)病的初始體重為（22.18±0.35）g的軍曹魚幼魚，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)共分為11個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，以重復(fù)為單位養(yǎng)殖于2.5ｍ×1.2ｍ×1.4ｍ的網(wǎng)箱，共33個(gè)網(wǎng)箱，每個(gè)網(wǎng)箱放30尾魚。為減少試驗(yàn)誤差，所有網(wǎng)箱均隨機(jī)擺放。每種飼料投喂3個(gè)網(wǎng)箱，每天飽食投喂2次（07：00、18：00），日投喂量為其體重的6％～9％。養(yǎng)殖期間水體溫度28～33℃，pH7.6～7.8，鹽度29～31，溶氧濃度＞6.0mg/L，試驗(yàn)期為10周。養(yǎng)殖海水中Co含量為０.12μg/L。

1.4 樣本采集及測(cè)定

     試驗(yàn)結(jié)束后禁食24h后采樣，以每個(gè)網(wǎng)箱為單位稱重計(jì)數(shù)。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾魚（丁香酚麻醉處理），用2.5mL的注射器從魚體心臟抽血，放置于1.5mL的Eppendorf管中，制備抗凝血，待測(cè)血液學(xué)指標(biāo)。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾魚，解剖后迅速取出肝臟放入防凍管，然后放入液氮罐保存，最后轉(zhuǎn)移到-80℃中冰箱備用。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取8尾魚，去除內(nèi)臟后放入沸水中3min，然后剝離肌肉，取出脊椎骨，以超純水沖洗去掉附著的肌肉。處理后的脊椎骨在105℃烘干，然后粉碎過(guò)80目篩，以乙醚抽提12h去除脂肪，并再次105℃烘干。

    飼料營(yíng)養(yǎng)成分分析：水分含量采用105℃常壓干燥法測(cè)定；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法（Kjeltec™8400，瑞典）測(cè)定；粗脂肪含量采用索氏抽提法（乙醚為抽提劑）測(cè)定；粗灰分含量采用550℃馬弗爐灼燒法測(cè)定。 

    礦物元素測(cè)定：飼料、全魚、肝臟和脊椎骨105℃烘干后粉碎過(guò)80目篩，然后用硝酸和雙氧水充分消解，用電感耦合等離子體－質(zhì)譜法測(cè)定飼料、全魚、脊椎骨和肝臟中Co含量。

   血液學(xué)指標(biāo)如紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）均采用法國(guó)PEN-TRA 80全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定。

1.5 生長(zhǎng)性能計(jì)算公式

    末均重（FBW，g）＝總末重（g）/魚尾數(shù)；

    增重率（WGR，％）＝100×［末均重（g）-初均重（g）］/初均重（g）；

    特定生長(zhǎng)率（SGR，％/d）=100×［ln末均重（g）-ln初均重（g）］/飼養(yǎng)天數(shù)（d）；

    飼料系數(shù)（FCR）=攝食飼料干重（g）/［末均重（g）-初均重（g）］；

    成活率（SR，％）=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SE）表示，采用SPSS 17.0的一般線性模型軟件進(jìn)行雙因素方差分析（two-way ANOVA），模型的主效應(yīng)分析包括Co源、Co含量以及兩者之間的互作效應(yīng)。若存在顯著差異，再采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。Co-Met相對(duì)于Co-Cl的生物學(xué)效價(jià)采用比斜率法求得。

2.1 飼料Co源和Co含量對(duì)軍曹魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

    由表3可知，2種Co源下SGR、FBW、WGR均隨飼料Co含量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。C-0組的SGR和WGR均顯著低于以Co-Cl為Co源的Co-Cl-4、Co-Cl-8、Co-Cl-16和Co-Cl-32組以及以Co-Met為Co源的Co-Met-4、Co-Met-8、Co-Met-16和Co-Met-32組（p<0.05）。Co-Cl-32和Co-Met-32組SGR和WGR均顯著低于Co-Cl-16和Co-Met-16組（P<0.05）。Co-Cl組中，WGR及FBW在Co-Cl-16組最大；Co-Met組中，WGR及FBW在Co-Met-8組最大。Co-Cl組中，SR在Co-Cl-32組最低，顯著低于除Co-Cl-4組外的其他各組（P<0.05），且FCR顯著高于Co-Cl-2、Co-Cl-8和Co-Cl-16組（P<0.05）；Co-Met組中，Co-Met-8組SR相比Co-0組顯著降低（P<0.05），但其他組與Co-0組無(wú)顯著差異（P＞0.05），Co-Met-2組FCR顯著高于Co-Met-16組（P<0.05）。雙因素方差分析顯示，飼料Co含量對(duì)FBW、SGR、WGR和FCR有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)SR無(wú)顯著影響（P＞0.05）；飼料Co源對(duì)FBW、SGR、WGR、FCR和SR均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；飼料Co源與Co含量的交互作用對(duì)SGR、WGR和SR有顯著影響（P<0.05），對(duì)FBW和FCR無(wú)顯著影響（P＞0.05）。以SGR為依據(jù)時(shí)，通過(guò)二次回歸曲線分析得出飼料中添加Co-Cl和Co-Met形式的Co分別至19.40和17.75mg/kg時(shí)，軍曹魚幼魚可以獲得最大SGR（圖1）。由圖2可知，以SGR為判據(jù)，軍曹魚幼魚對(duì)Co-Met的生物學(xué)效價(jià)（以Co-Cl為基準(zhǔn)）相當(dāng)于Co-Cl的1.47倍（線性模擬結(jié)果，以Co-Cl為Co源：ｙ＝0.0188ｘ＋2.5276，R²＝0.9968；以Co-Met為Co源：ｙ＝0.0277ｘ＋2.5108，R²＝0.9752；Co-Met相對(duì)于Co-Cl的生物學(xué)效價(jià)＝0.0277／0.0188＝1.47）。

3.1 飼料Co源和Co含量對(duì)軍曹魚幼魚生長(zhǎng)性能的影響

    本試驗(yàn)條件下（去維生素B₁₂），軍曹魚幼魚的SGR及WGR均隨著飼料Co含量的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，以SGR為判據(jù)，軍曹魚幼魚對(duì)Co-Cl和Co-Met形式的Co的需要量分別為19.40和17.75mg/kg。魚類對(duì)Co的需要量可能受魚的種類（海水魚、淡水魚）、基礎(chǔ)飼料中維生素B₁₂含量、養(yǎng)殖水體Co含量、Co源種類、魚的規(guī)格、基礎(chǔ)飼料組成、評(píng)定指標(biāo)的影響。研究報(bào)道，以WGR為判據(jù)，點(diǎn)帶石斑魚對(duì)Co的需要量為10mg/kg；在飼料中缺少維生素B₁₂的情況下，草魚幼魚獲得最佳生長(zhǎng)時(shí)對(duì)飼料中Co的需要量大約為0.88mg/kg，在未去維生素B₁₂的情況下，對(duì)Co的需要量為0.20mg/kg。飼料中Co-Met的添加量為15mg/kg時(shí)凡納濱對(duì)蝦（PenaeusVanmamei）生長(zhǎng)最快；尼羅羅非幼魚對(duì)飼料中Co的需要量為0.3～3.0mg/kg；牙鲆幼魚（Paralichthys olivaceus）在基礎(chǔ)飼料Co含量為1.43mg/kg時(shí)Co的適宜添加量為0.8mg/kg。Co促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的主要原因可能為：1）Co促進(jìn)動(dòng)物腸道微生物群合成動(dòng)物生長(zhǎng)所需的維生素B₁₂，維生素B₁₂是造血性維生素，是動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的；2）Co通過(guò)輔酶形式參與機(jī)體造血和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、糖類、脂肪）的代謝過(guò)程，促進(jìn)氮的吸收，促進(jìn)生長(zhǎng)；3）適宜含量的Co改善了魚類腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)，保護(hù)了魚類器官組織；4）Co通過(guò)影響相關(guān)基因的表達(dá)，提升動(dòng)物的抗氧化能力和增強(qiáng)抗炎反應(yīng)。然而，高劑量（32mg/kg）添加組軍曹魚幼魚的生長(zhǎng)性能出現(xiàn)下降，SR顯著降低，這表明軍曹魚幼魚對(duì)該劑量的Co不耐受，這與草魚試驗(yàn)中0.95和1.63mg/kgCo組在試驗(yàn)后期生長(zhǎng)變緩的結(jié)果一致。分析其原因，飼料Co含量過(guò)高可能產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致腸道出血或損傷和白血球的異常變化。另外，鐵、錳和Co共用部分轉(zhuǎn)運(yùn)通道，過(guò)量增加Co會(huì)抑制鐵和錳的吸收利用。以Co-Met為Co源，SR在Co-Met-8組顯著下降，其他Co-Met組與Ｃ-0組均無(wú)顯著差異，WGR和SGR也在該組顯著提升，說(shuō)明SR顯著降低不是Co含量導(dǎo)致。實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，影響SR的因素很多，包括飼料質(zhì)量、具體養(yǎng)殖環(huán)境、偶然的病害因素、某種未知的偶然因素等，其原因有待探究。

3.2 飼料Co源和Co含量對(duì)軍曹魚幼魚血液學(xué)指標(biāo)的影響

     Co增強(qiáng)機(jī)體造血機(jī)能的渠道有：1）Co抑制細(xì)胞多種重要酶（如細(xì)胞色素氧化酶）活性或通過(guò)其他方式使機(jī)體紅細(xì)胞生成素（Epo）增多刺激造血；2）適宜含量的Co可以促進(jìn)鐵的吸收，使鐵較易進(jìn)入骨髓利用；3）Co通過(guò)維生素B₁₂參與核糖核酸及造血有關(guān)物質(zhì)的代謝，作用于造血過(guò)程。研究顯示，尼羅羅非魚的紅細(xì)胞比容、HGB、RBC均受Co的影響而顯著提升；飼料中添加Co可以提高草魚幼魚的HGB、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、HCT和RBC。Co可以穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF-1α），激活促紅細(xì)胞生成素基因，增強(qiáng)血紅蛋白紅血球的合成。本試驗(yàn)中，2種Co源下添加不同水平Co后，軍曹魚幼魚的RBC、HGB、HCT均有不同程度是上升，與前人研究結(jié)果一致。Ｃ-0組軍曹魚幼魚的各血液學(xué)指標(biāo)均低于各Co添加組，說(shuō)明海水及基礎(chǔ)飼料中的Co并不能滿足軍曹魚幼魚正常生理需要。2種Co源下，添加32mg/kgCo組的RBC、HGB、HCT均比添加16mg/kgCo組有所下降，說(shuō)明Co含量過(guò)高反而會(huì)對(duì)造血能力有不利影響。

3.3 飼料Co源和Co含量對(duì)軍曹魚幼魚組織Co沉積的影響

    魚類肝臟、肌肉、腎臟、脊椎骨等組織中Co含量常用來(lái)評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)狀況。在珍珠龍膽（EEpinephelus lanceolatu♂×E. fuscoguttatus♀）上的研究表明，肝臟、腸道、脊椎骨、肌肉、全魚鈷沉積量均隨Co含量的增加顯著上升，且肝臟沉積速率最快，在最高Co添加組達(dá)到最大沉積量2.27mg/kg。尼羅羅非魚肝臟Co沉積量隨飼料Co含量的增加而顯著上升，當(dāng)飼料中Co含量達(dá)到2.67mg/kg及以上時(shí)Co沉積量穩(wěn)定在1.73mg/kg。源于Co-Met的飼料Co含量對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉和肝胰臟Co含量未產(chǎn)生顯著影響，但源于Co-Cl的飼料Co含量對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟Co含量有顯著影響，Co添加量為15mg/kg時(shí)，肝胰腺Co含量達(dá)到最高值6.05mg/kg，顯著高于對(duì)照組。這些研究結(jié)果顯示，肝臟Co含量受飼料Co含量的影響。本試驗(yàn)中，軍曹魚幼魚脊椎骨和全魚Co含量均隨著飼料Co含量的增加而升高，說(shuō)明組織Co沉積量上升，與前人研究結(jié)果基本一致。肝臟通常為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的主要器官，或作為Co的主要儲(chǔ)存器官。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟中Co含量不受飼料Co源和Co含量的顯著影響。與前人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，不同種類魚肝臟對(duì)Co的儲(chǔ)存能力不同，軍曹魚幼魚肝臟Co含量可能較易達(dá)到飽和，從而保持平穩(wěn)。在草魚幼魚的結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，飼料Co含量在0.17～1.57mg/kg時(shí)，各組肝臟Co含量無(wú)顯著差異。這可能也說(shuō)明魚類肝臟具有Co穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)其達(dá)到飽和時(shí)含量不再增加。

3.4 不同Co源生物學(xué)效價(jià)比較

    不同礦物元素在機(jī)體內(nèi)的吸收利用通常存在一定的拮抗作用，如鐵和銅之間，鋅和鐵、錳、銅之間，Co和錳之間等。加之，飼料原料中存在的植酸、纖維素和磷酸根等，干擾微量元素的吸收，如白魚粉中大量的羥磷灰石會(huì)降低魚類對(duì)鋅的利用。生物學(xué)效價(jià)常用來(lái)比較不同營(yíng)養(yǎng)物被機(jī)體吸收利用的效率。有機(jī)螯合物相比無(wú)機(jī)化合物通常具有較高的生物學(xué)效價(jià)。研究顯示，羥基蛋氨酸錳的生物學(xué)效價(jià)是硫酸錳的1.09～2.47倍，蛋氨酸鋅的生物學(xué)效價(jià)是硫酸鋅的3倍左右，蛋氨酸硒的生物學(xué)效價(jià)是亞硒酸鈉的1.20～2.90倍。本試驗(yàn)以SGR、RBC、脊椎骨Co含量為判據(jù)，Co-Met的生物學(xué)效價(jià)分別相當(dāng)于Co-Cl的1.47、1.49、1.12倍。分析其原因，Co-Met是一種新型氨基酸螯合劑，Met與Co的螯合比為2∶1，為無(wú)價(jià)態(tài)的絡(luò)合物，可以順利通過(guò)富含陰離子的細(xì)胞膜；微量元素的氨基酸螯合物可能是以氨基酸形式吸收，避免了微量元素之間的拮抗作用，不僅可以提高Co的利用，還有利其他元素的吸收；同時(shí)，Co-Met也可以提供Met，而Met是魚類的第一限制性氨基酸。因此，Co-Met具有雙重營(yíng)養(yǎng)功能，能夠較好為軍曹魚幼魚機(jī)體利用。