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隨著我國飼料資源的日趨緊張及抗生素的禁用，積極尋找健康多元化的飼料資源及安全高效的飼料生產(chǎn)模式，成為了畜牧工作者亟待解決的首要任務(wù)。發(fā)酵飼料作為一種新型、綠色的環(huán)境友好型飼料，制作過程中有益微生物大量繁殖，可將飼料中蛋白質(zhì)分解為氨基酸及小分子的肽，淀粉分解發(fā)生糖化、酸化，兼?zhèn)湮⑸鷳B(tài)制劑、酶及糖化處理的功能。然而，發(fā)酵飼料在畜禽上應(yīng)用的研究結(jié)果并非十分一致。大多研究表明，發(fā)酵飼料對畜禽日增重、飼料轉(zhuǎn)化效率、免疫功能及腸道健康等方面均體現(xiàn)出一定的促進作用。另有結(jié)果顯示，飼料中蛋白質(zhì)經(jīng)發(fā)酵脫羧產(chǎn)生生物胺，其過度積累將導(dǎo)致飼料適口性降低及氨基酸的不可逆損失。發(fā)酵飼料制作工藝的不同，是其飼用效果呈現(xiàn)多樣性的重要原因，亦是其功能性評價成敗的關(guān)鍵。因此，本試驗采用固體發(fā)酵工藝制備固態(tài)發(fā)酵醋糟飼料(solid-state fermentation vinegar dregs，SFVD)，并研究其對育肥豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、血清指標(biāo)及糞便中揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)含量的影響，以期為新型生物飼料的研發(fā)與應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1  材料與方法

1.1  試驗材料

發(fā)酵菌種:布拉式酵母菌(Saccharomyces bou lardji)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)均由北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司提供。

胰蛋白胨、酵母提取物購于英國 Oxoid 公司，氯化鈉(NaCl)、葡萄糖購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MＲS 培養(yǎng)基)購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)組成見表 1。

1.2  試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選擇體況相近［(59.04±0.33)］kg 的健康“杜 × 長 × 大”三元雜交育肥豬 60 頭，隨機分為 2 個組，每組 3 個重復(fù)，每個重復(fù) 10 頭豬，各重復(fù)間初始體重差異不顯著(P ＞ 0.05)。基礎(chǔ)飼糧參考NＲC(2012)營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 2.對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧 +150 mg /kg 土霉素鈣，試驗組飼喂基礎(chǔ)飼糧 +5%的 SFVD。自由采食和飲水，預(yù)試期 6 d，正試期 35 d。

試驗開始前對豬舍進行全面清掃、消毒，試驗期間每周進行 1 次豬舍消毒。豬舍內(nèi)環(huán)境溫度維持在 20～25 ℃，相對濕度為 65%。豬只管理和免疫按常規(guī)進行。動物試驗于 2018 年 12 月 6 日至2019 年 1 月 10 日在重慶市畜牧科學(xué)院動物營養(yǎng)研究所進行。

1.3  SFVD 的配制

據(jù)課題組前期研究結(jié)果，試驗對 SFVD 制備工藝進一步優(yōu)化:植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌及布拉式酵母菌液分別接種于液體 MＲS(37 ℃靜置培養(yǎng) 16 h)、LB(37 ℃、220 r/min 培養(yǎng) 16 h)和 YPD培養(yǎng)基(30 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 24 h)培養(yǎng)后，分別以 1%接種量接種于發(fā)酵罐中，控制罐壓、通氣量、溶氧、pH 及溫度等條件。裝袋密封，室溫厭氧發(fā)酵 5 d。飼料需于開袋后 15 d 內(nèi)使用完畢，隨用隨取，隨取隨封，嚴(yán)防二次發(fā)酵及霉菌污染。發(fā)酵菌種的培養(yǎng)均采用先搖瓶、后發(fā)酵罐的擴繁模式。發(fā)酵罐容積 50 L，植物乳桿菌和地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基添加量為 35 L /罐，布拉式酵母菌培養(yǎng)基添加量為 30 L /罐。布拉式酵母菌培養(yǎng)過程中，當(dāng)溶氧解含 量 開 始 回 升 時，補料5 L，流 速 控 制 為30 mL /(h•L)。菌種的培養(yǎng)工藝詳見表 3，生物飼料組成及營養(yǎng)水平見表 4。

1.4  樣品采集與指標(biāo)測定

1.4.1  生長性能測定

每天記錄仔豬采食量，試驗前后對仔豬進行稱重，并根據(jù)以上數(shù)據(jù)計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2  常規(guī)養(yǎng)分含量的測定

糞樣、飼料樣中的干物質(zhì)( DM ) 含量采用105 ℃烘干法(GB /T 6435—2006)測定，粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用凱氏半微量定氮法(GB /T 6432—1994)測定，粗脂肪(EE)含量采用索氏乙醚提取法(GB /T 6433—2006)測定，粗灰分(Ash)含量采用 550 ℃ 灰化法(GB /T 6438—2007) 測定，粗纖維( CF) 含 量 參 照 GB /T 6434—2006/ISO 68652000 的方法測定;鉻含量參照 GB /T 13088—2006的方法，經(jīng)濕法消解(硝酸加高氯酸)處理后，使用原子吸收光譜儀(日立 －Z－5000，日立集團，日本)測定。

1.4.3  養(yǎng)分表觀消化率的測定

在正試期第 30 ～ 35 天的飼糧中添加 0.3%的三氧化二鉻(Cr 2O 3)作為外源指示劑，測定養(yǎng)分表觀消化率。3 d 預(yù)試期后，于試驗期第 33～35 天，每天從每個重復(fù)中選取有代表性的糞樣約 200 g，－20 ℃保存。將 3 d 的糞樣混合均勻，一部分用于VFA 含量的測定;一部分置于 65 ℃ 烘箱中 72 h，回潮 24 h 后，粉碎樣品過 40 目，按照四分法取樣500 g，－4 ℃保存待測。

養(yǎng)分表觀消化率(%)= 100－［(飼糧中鉻含量 × 糞中某養(yǎng)分含量) /(糞中鉻含量 ×飼糧中某養(yǎng)分含量)］×100。

1.4.4  血樣的采集、處理與測定

于正試期第 35 天晨飼前，每個重復(fù)選擇 3 頭豬，空腹經(jīng)前腔靜脈采血 15 mL 于真空促凝采血管中，傾 斜 靜 止 30 min 后，4 000 r/min 離 心10 min，分離血清，－20 ℃ 保存，用于血清生化、抗氧化及免疫指標(biāo)的測定。

谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶 ( aspartate aminotransferase，AST)、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶 ( alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 活性及總蛋白(total protein，TP)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、尿素氮(urea nitrogen，UN)含量使用 COBUS MIＲA Plus 自動生化分析儀測定。

化學(xué)比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，酶聯(lián)免疫吸附法測定免疫球蛋白 A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白 G(immunoglobulinG，IgG)含量，所用試劑盒購于南京建成生物工程研究所，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5  數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用 SAS 9.2 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異性及趨勢性判定標(biāo)準(zhǔn)分別為 P＜0.05 和 0.05≤P＜0.10。

2  結(jié)果與分析

2.1 SFVD  對育肥豬生長性能的影響

由表 5 可見，與對照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 對育肥豬 ADFI 具有一定的促進趨勢(P=0.056)，對 ADG 和 F/G 均沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.2  SFVD 對育肥豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表 6 可見，與對照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 顯著降低了育肥豬飼糧中 DM、CP、OM 和 GE 表觀消化率(P＜0.05)，對 EE 表觀消化率有一定的促進趨勢(P= 0.052)，對 CF 表觀消化率沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.3  SFVD 對育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

由表 7 可見，與對照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 AST 活性(P＜0.05)，血清AST /ALT 和HDL 含量也呈現(xiàn)出一定的升高趨勢(P = 0.082 和 P= 0.055)，對血清ALT、ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.4  SFVD 對育肥豬血清抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

由表 8 可見，與對照組相比，基礎(chǔ)飼糧中添加5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 GSH-Px 活性(P＜0.05)，對血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均沒有顯著影響(P＞0.05);血清 IgA 含量呈現(xiàn)出一定的升高趨勢(P = 0.077)，而對血清 IgG 含量沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.5  SFVD 對育肥豬糞便中 VFA 含量的影響

3  討 論

3.1  SFVD 對 育 肥 豬 生 長 性 能 和 養(yǎng) 分 表 觀消化率的影響

飼料經(jīng)發(fā)酵處理后，可將飼料中的大分子有機物降解為更容易被機體利用的小分子物質(zhì)，同時產(chǎn)生大量菌體蛋白及多種代謝產(chǎn)物。其中，乳酸及多種 VFA 的存在使其具備酸香味，從而改善飼料適口性，邏輯上利于動物生長性能的提高。然而，發(fā)酵飼料對動物生長性能及養(yǎng)分消化率方面的研究結(jié)論卻并不十分一致。

眾多研究表明，發(fā)酵飼料對育肥豬、肉雞、肉兔、朗德鵝、羔羊及肉牛的生長性能及表觀消化率均表現(xiàn)出良好的促進作用。周映華等采用復(fù)合菌種(乳酸菌∶釀酒酵母∶枯草芽孢桿菌 =1∶1∶1)對育肥豬全價飼料進行發(fā)酵，結(jié)果顯示，發(fā)酵飼料與基礎(chǔ)飼糧 1∶4 混合使用，能夠顯著提高育肥豬的 ADG 和 ADFI，降低F/G，同時顯著提高飼糧中 CP 和 CF 的表觀消化率，這與 Hu 等的研究結(jié)果吻合。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD 使飼糧適口性得到改善，進而提高了育肥豬的 ADFI，這與前期眾多報 道 一 致。此 外，基 礎(chǔ) 飼 糧 中 添 加 5% 的SFVD 對育肥豬的 ADG 和 F/G 均沒有造成顯著影響，可能與飼糧中 DM、CP、OM 和 GE 的表觀消化率降低有關(guān)。研究表明，飼糧中 CF 水平每提高1%，反芻動物 OM 的消化率降低 0.65% ～0.70%，單胃動物降低 1.35% ～1.40%，且不同纖維源對營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響不同。本試驗以醋糟和小麥麩為纖維源制作的 SFVD(CF 含量 16.4%)，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD 使育肥豬飼糧 CF 表觀消化率提高了 0. 61%，OM 表觀消化率降低了1.69%，這可能與所選纖維源不可溶非淀粉多糖(insoluble non-starch polysaccharide，INSP)含量較高有關(guān)。飼糧中可溶性非淀粉多糖(soluble non-starch polysaccharide，SNSP)含量過高可造成食糜的營養(yǎng)屏障效應(yīng)，而 INSP 含量過高使食糜流通速度加快，是導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消化率降低的重要原因。因此，不同制備工藝的生物飼料對育肥豬生長性能及養(yǎng)分表觀消化率的影響不同，而有關(guān)纖維組分與養(yǎng)分表觀消化率間的相關(guān)性及其作用機理的研究，尚需進一步證實。

3.2  SFVD 對育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)是反映機體代謝及各組織器官功能的間接體現(xiàn)。正常生理狀態(tài)下，ALT 和 AST分別主要存在于胞質(zhì)和線粒體中，尤以肝臟和心肌細(xì)胞中活性最高。當(dāng)細(xì)胞受損時，胞膜通透性改變，大量的 ALT 和 AST 涌入血液，致使血液中ALT 和 AST 活性升高。因此，ALT 和 AST 常被用作肝臟及心肌疾患檢測的敏感指標(biāo)。本試驗條件下，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD 顯著提高了育肥豬血清 AST 活性，提示可能對心肌細(xì)胞產(chǎn)生了負(fù)面影響，但由于 2 組血清 AST 活性均處于較低水平，臨床學(xué)意義不大，故在此不做冗余討論。此外，在血清 AST 和 ALT 活性均未出現(xiàn)顯著異常的前提下，AST /ALT 的上升并不足以斷定本研究過程中出現(xiàn)了肝損傷。

研究表明，飼喂發(fā)酵飼料能夠提高豬血清 TP和 UN 含量，促進機體蛋白質(zhì)的整體代謝，同時對血清 ALP 活性具有顯著的促進作用，提示發(fā)酵飼料的使用對豬的生長發(fā)育具有潛在的促進作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的 SFVD并未對育肥豬血清 TP、UN 含量及 ALP 活性造成顯著影響，這可能與發(fā)酵飼料的原料、工藝及使用量密切相關(guān)。值得一提的是，試驗組血清中 HDL含量呈現(xiàn)出高于對照組的趨勢，提示 SFVD 對育肥豬血脂代謝可能具有潛在促進作用，推測原因可能與 VFA 的大量產(chǎn)生有關(guān)，本研究結(jié)果與前人報道基本一致。此外，本試驗條件下，2 組間血清 ALP 活性及 TP、UN、CHOL、TG 和 LDL 含量均未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。

3.3  SFVD 對育肥豬血清抗氧化和免疫指標(biāo)的影響

發(fā)酵飼料中含有豐富的微生物，可作為獨立抗原，在刺激機體免疫系統(tǒng)和提高氧化應(yīng)激能力等方面具有重要的作用。徐秀景等試驗表明，采用乳酸菌發(fā)酵飼料飼喂生長育肥豬，能夠提高血清中 GHS-Px 等抗氧化物酶活性，增強機體抗氧化能力。本試驗條件下，基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的SFVD 顯著提高了育肥豬血清 GSH-Px 活性，而對血清 SOD、CAT 活性及 MDA 含量均未造成顯著影響。本試驗采用的 SFVD 含有豐富的植物乳桿菌(2.7×10 7 CFU /g)等益生菌，可通過與金屬離子螯合，降低羥自由基前體的含量，也能產(chǎn)生 GSH-Px、阿魏酸酯酶(FAE)以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶，阻止高活性氧的形成，從而提高機體抗氧化能力。

此外，有研究表明，采用無抗生素發(fā)酵飼料飼喂斷奶仔豬，可以通過增加小腸上皮間淋巴細(xì)胞、M 細(xì)胞和 CD3 + T 細(xì)胞數(shù)量，進而提高小腸的黏膜免疫 。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗組血清 IgA 含量呈現(xiàn)出一定升高趨勢，提示 SFVD 也可能對育肥豬的黏膜免疫具有潛在的促進作用，這與 Ahmed 等的研究結(jié)果一致。盡管研究者對發(fā)酵飼料提高機體免疫功能的觀點普遍認(rèn)可，但其微生物與機體免疫間可能存在的對話機制仍有待畜牧工作者進一步探索。

3.4  SFVD 對育肥豬糞便中 VFA 含量的影響

腸道中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的 VFA 主要以乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)為主。報道顯示，VFA 與腸上皮細(xì)胞的代謝、增殖分化、肝臟的脂質(zhì)代謝等密切相關(guān)。值得強調(diào)的是，腸道中 VFA 總量的 95%可被吸收代謝，最高可提供宿主所需能量的9% 。本 研 究 顯 示，基 礎(chǔ) 飼 糧 中 添 加 5% 的SFVD 顯著提高了育肥豬糞便中丙酸含量，糞便中甲酸和 TVFA 含量也呈現(xiàn)出一定的升高趨勢，而對糞便中乳酸、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量沒有顯著影響。推測可能與飼糧結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，一方面，試驗組相對較高的纖維水平，為動物后腸道產(chǎn) VFA 菌群提供了良好的培養(yǎng)基質(zhì);另一方面也可能與 SFVD 自身含有的高活菌數(shù)及VFA 有關(guān)，提示本工藝條件下的 SFVD 對腸道健康具有潛在的促進作用。

眾多學(xué)者認(rèn)為，VFA 可通過降低腸道 pH 來抵御感染及致病菌的侵襲。研究表明，飼喂發(fā)酵飼料可降低不同腸段腸桿菌科和沙門氏菌數(shù)量，提高乳酸桿菌數(shù)量，推測原因為發(fā)酵飼料使腸道中乳酸及 VFA 含量增加，導(dǎo)致 pH下降所致。菌體細(xì)胞內(nèi)酸解離導(dǎo)致 pH 下降，從而致使酶和質(zhì)子動力泵坍塌，輔以陰離子自身的殺傷效應(yīng)，達到破壞菌體的效果。誠然，pH對腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定至關(guān)重要，而另有學(xué)者認(rèn)為，解離的乳酸和 VFA 不能自由穿越菌體膜，因而腸桿菌科和沙門氏菌數(shù)量的減少只與未解離的部分有關(guān)。盡管 VFA 對腸道健康的正面效應(yīng)已被眾多研究者普遍認(rèn)可，但飼糧 － 菌群 －VFA軸的相關(guān)性尚不十分明確。有關(guān)飼糧對宿主腸道微生物的調(diào)控機制研究，將是本課題組接下來的重要探究內(nèi)容之一。

4  結(jié) 論

基礎(chǔ)飼糧中添加 5%的本工藝條件下制備的SFVD 對育肥豬生長性能、腸道健康及免疫性能的提高具有潛在的促進作用。

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