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菌酶協同處理豆粕制備飼用小肽的研究

2021-05-18 15:01:25      點擊:

摘要:以小肽含量為指標研究了芽孢桿菌、酵母菌和中性蛋白酶協同發酵、酶解處理豆粕制備飼用小肽的工藝條件。

結果表明:菌酶協同處理豆粕的最佳條件為混合菌接種量1.5%、加酶量450 U/g、料水比1:1.4、發酵溫度40℃、發酵時間48h。在此條件下,豆粕經菌酶協同處理后,小肽含量從11.40mg/g提高到199.65mg/g粗蛋白質含量從47.62%提高到56.72%。

傳統營養理論認為,蛋白質必須被消化成游離氨基酸之后才可被消化道吸收利用,蛋白質營養即是氨基酸營養。而新的研究表明,蛋白質經消化道酶降解成游離氨基酸和各種小肽后。小肽以完整的形式和游離氨基酸同時被動物直接吸收利用(陳培賽和薛成君,2008;Backwell,1997b)。小肽是指由多個氨基酸殘基組成的具有多種生物功能的肽(崔艷紅,2009)。小肽在動物機體內的作用主要有傳遞神經息、促進胃腸道消化功能、強化養分與吸收、調控物質代謝、參與機體的免疫調節等(Boze,2000;Backwell,1997a)。豆粕是一種優質的飼用蛋白原料,具有較高的蛋白質含量,其氨基酸組成也較平衡,是一種潛在的優質小肽資源(Adetayo,2005),傳統的豆粕發酵主要是利用微生物的作用降低豆粕中的抗營養因子,或利用蛋白酶水解豆粕制備大豆肽,而采用微生物發酵和酶解協同作用處理豆粕。更有效地提高豆粕小肽化程度的報道較少(Lee,2005)。

本研究采用芽孢桿菌、酵母菌和中性蛋白酶混合處理豆粕,并優化菌酶協同處理豆粕工藝,以期獲得小肽化程度更高的飼用肽,進而提高豆粕的利用率與蛋白質品質。

材料與方法

1 材料

豆粕:浙江某生物科技有限公司提供,去皮豆粕,粗蛋白質≥45%。

菌種:BSW一2為枯草芽孢桿菌(Bacillussub.tilis),YT為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisi.ate),均為本實驗室保藏菌株。

中性蛋白酶:購于上海某生物科技有限公司,酶活≥50U/g;

酶活定義:在(40±0.2)℃,pH7.0條件下,1min內水解酪蛋白底物,產生相當于1μg酚類化合物(由酪氨酸等同物表示)所需的酶量,定義為1個酶活單位,以u/g表示(DB33/T 459-2003)。

2 培養基

PDA培養基:馬鈴薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、水1000mL、pH值自然;LB培養基:蛋白棟10g、酵母粉5g、氯化鈉10g、水1000 mL、pH7.0。

3 方法

3.1 液體種子的制備

枯草芽孢桿菌經斜面活化后刮取一環接人20mL液體LB培養基,在30℃,160r/min條件下搖瓶培養12h,制成種子液:酵母菌經斜面活化后刮取一環接入20mL液體PDA培養基,在30℃,160r/min條件下搖瓶培養18h。制成種子液。

3.2 豆粕發酵方法

豆粕基礎菌酶協同處理條件為裝料量100g/瓶、中性蛋白酶添加量400u/g、BSW-2和YT接種量各1%、料水比1:1、發酵溫度30℃、發酵時間48h基礎上,豆粕以一定比例加水,接種,加酶,混合均勻后裝入罐頭瓶中,用8層紗布加報紙封口,放入培養箱中,設定溫度,在實驗選取的時間取出,50℃烘干,粉碎,過80目篩待測。

3.3 豆粕菌酶混合發酵單因素試驗

3.3.1 接種量對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上??刂破渌蛩夭蛔?,分別接種0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的BSW-2和YT混合菌液(比例為1:1)進行發酵,發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

3.3.2 加酶量對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上,控制其他因素不變,分別添加0、100、150、200、250、300、350、400、450、500U/g中性蛋白酶進行發酵,發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

3.3.3 料水比對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上,控制其他因素不變,分別按料水比1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8加水進行發酵,發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

3.3.4 處理溫度對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上,控制其他因素不變,分別設定30、35、40、45、50℃的溫度進行發酵,發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

3.3.5 處理時間對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上??刂破渌蛩夭蛔?,分別設定0、12、24、36、48、60、72h的時間進行發酵,發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

3.4 菌酶協同處理工藝優化

根據單因素試驗結果,設計5因素4水平L16(45)的正交試驗進行發酵工藝優化。發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽、粗蛋白質含量和進行聚丙烯酰胺變性凝膠電泳(SDS—PAGE)。

3.5 發酵樣品小肽含量的測定

將待測樣品過80目篩,等體積加入10%三氯乙酸(TCA),在160r/min搖床中30 min。然后4000r/min離心15min。取上清液做適當稀釋后用改良Lowry法測定蛋白質總量(張康,2001;GB/T 22492—2008)。

3.6 發酵樣品粗蛋白質含量的測定

采用凱氏定氮法,參照GB/T 14771食品中蛋白質的測定方法(GB/T 14771)。

3.7 發酵樣品蛋白質降解度的檢測

發酵樣品蛋白質降解度的檢測采用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳法,(SDS—PAGE)。

結果與分析

1 豆粕菌酶混合發酵工藝的研究

1.1 接種量對小肽含量的影響

由圖1結果可知:小肽含量隨著接種量的增加,說明BSW一2+YT發酵可以使小肽含量得到提高。當接種量為2.5%時,豆粕發酵后小肽含量最高,為185.16mg/g。

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1.3 料水比對小肽含量的影響

料水比是影響固體發酵的重要因素之一。水分含量影響發酵過程中微生物的生長。同時對酶的作用影響也比較大。由圖3的結果可知,小肽的含量隨著料水比的增加,呈現先增大后減小的趨勢,當料水比為1:1.2時,小肽含量最高,為194.90mg/g。當料水比過大時,小肽含量呈現減少的趨勢,可能是由于芽孢桿菌這類好氧菌在水分過多時生長受到抑制,從而影響了蛋白質降解成小肽。

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1.4 發酵溫度對小肽含量的影響

溫度是影響酶活的重要因素,酶活的高低,直接影響到豆粕中蛋白質酶解成小肽。由圖4的結果可知,小肽含量隨溫度的升高,先增加后減少,當發酵溫度為40℃時,小肽含量最高,為192.73mg/g。

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1.5 發酵時間對小肽含量的影響

由圖5的結果可知:隨著發酵時間的延長,小肽的含量先上升后略有下降,當發酵時間為48h時,小肽含量最高為182.43mg/g。當發酵時間長于48h,隨著酶解時間的延長,小肽被進一步酶解生成游離氨基酸,含量反而出現下降趨勢,因此酶解時間不宜過長。

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2 豆粕菌酶混合發酵工藝優化

在單因素試驗的基礎上,得到各因素的適宜水平后,設計5因素4水平L16(45)的正交試驗進行發酵工藝優化,試驗因素水平編碼表、試驗設計及實施方案和結果見表1、表2。

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2.1 正交試驗結果的直觀分析

從表2直觀分析可以看出,極差列中接種量因素的極差值最大,所以得出結論接種量因素對小肽含量的影響最大,其次是發酵溫度、料水比、發酵時間、發加酶量。發酵最優條件為A1B3C2D4E3,即接種量1.5%,加酶量450u/g,料水比1:1.4,溫度40℃,時間60h。

2.2 發酵方案的確定

從正交表中觀察得知最優組合為A1B3C3D3E3,與理論最優條件A1B3C2D4E3對比可知發酵時間不同,結合單因素試驗結果,發酵時間過長小肽含量反而有所下降,因此對這兩種方案進行3次驗證試驗,測得小肽含量與粗蛋白質含量見表3。

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由表3可知,理論最優條件沒有正交表中最優組合結果好,因此最優條件為A1B3C3D3E3,即接種量1.5%,加酶量450u/g,料水比1:1.4,溫度40℃,時間48h,發酵結束后小肽含量從11.40mg/g提高到199.65mg/g;粗蛋白質從47.62%提高到56.72%。

2.3 SDS—PAGE電泳檢測蛋白降解程度

將最終確定的發酵工藝的發酵產品進行SDS—PAGE檢測,以原料豆粕做對照,結果見圖6。圖6結果顯示,與原豆粕相比,發酵產品中的大分子蛋白得到有效降解,生成小分子的多肽、小肽和氨基酸,其蛋白質的分子質量在45kDa以下,小于14.4kDa的占很大一部份,由此可見,發酵后豆粕的品質得到了有效提升。

討論

小肽的制備主要采用微生物發酵法和酶解法。從本質上講,微生物發酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用。微生物發酵法生產小肽的工藝主要有固體發酵和液體發酵。微生物固體發酵的優點是能較好地去除豆粕中的抗營養因子。發酵過程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等,其本身就是益生菌,有利于改善動物胃腸道的微生態環境,減少抗生素的應用和疾病的發生。本研究采用的是芽孢桿菌和酵母菌混合發酵豆粕,芽孢桿菌相對于霉菌來講,生長速度較快,發酵周期較短,降低了生產成本,并且在發酵過程中分泌蛋白酶,利用蛋白酶的內切作用將蛋白質降解成低分子質量的肽,因此對豆粕蛋白有較好的降解作用;酵母菌在發酵過程中產生酒香味,使發酵產品的風味有所提升,同時酵母本身也是很好的菌體蛋白,使豆粕發酵后的粗蛋白質提高。

目前酶解法制備小肽。主要采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶(劉通訊,2002)。萬琦(2003),劉大川和鐘方旭(1996)研究了5種蛋白酶:中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性,篩選出堿性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽,水解效果雖然較好,但是產物帶有強烈的苦味,需要采取一定的脫苦工藝后方可使用。王之盛和況應谷(2004)的研究結果表明,在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解,中堿性條件有利于7S和2S小分子質量抗原蛋白的進一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕,相對于堿性蛋白酶和酸性蛋白酶,避免固體發酵pH調節困難的問題,使發酵方式更為簡單有效。

菌酶混合協同處理法生產小肽,充分利用微生物發酵與酶解各自的優勢。發揮微生物與蛋白酶的協同作用使豆粕蛋白降解更充分,小肽化程度更高,同時避免了酶解產品的苦味,提高產品風味及適口性,進一步改善了豆粕飼用肽產品品質和營養價值。這對實現飼用肽的工業化生產具有重要的參考價值。

結論

以豆粕為原料,利用芽孢桿菌、酵母菌、中性蛋白酶混合發酵豆粕生產小肽飼料。在接種量1.5%、加酶量450U/g、料水比1:1.4、發酵溫度40℃、發酵時間48h條件下。豆粕發酵后,小肽含量和粗蛋白含質量都有顯著提高,小肽含量從11.40mg/g提高到199.65mg/g;粗蛋白質從47.62提高到56.72%。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺,而棉菜籽餅(棉籽粕、菜籽粕)價格相對便宜,棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣,蛋白質含量較高,含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質,這些物質含有一定的毒性,還會影響動物的消化吸收,不能大量使用,因此不建議直接飼喂給動物!

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現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術,可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料,直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅(發酵前的重量)代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物,在發酵過程中分泌的代謝產物,可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料,無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%,賴氨酸含量為2.5%-3.0%,色氨酸含量為0.6%-0.7%,蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間,特點是蛋氨酸含量高(僅次于芝麻餅、粕),賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低,是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低(淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用)。礦物質中,鈣和磷的含量均高,硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%,僅次于豆粕的蛋白質含量48%,而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%,而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%,只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸,在不需要額外加入動物性蛋白的情況下,僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜,促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時,豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分,其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒,但在一定溫度和水分條件下,經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大,從而造成動物生長速度下降,繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化,降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝,造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理,并且使用時要加以限制,具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大,而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時,應結合菜粕的氨基酸組成特點,適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸,尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中,由于蒸炒,壓榨等熱作用,大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚,結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收,故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中,這部分游離棉酚對動物毒性較大,尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長,可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降,甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害,因此,在使用棉餅、粕時,要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下,棉籽餅、粕的用量不受限制,不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量,最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時,使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡,尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低,且利用率差,應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術,具體操作如下:

1.仔細檢查棉菜籽餅,剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分,輕度發霉的原料可以忽略,因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等,調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉(其它淀粉、面粉次粉等也可以,或者粉碎的生紅薯300公斤也可以)100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包(500g/包,市場售價約25元,以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑)。

4.在混合物料中添加適量水分,使混合物料含水量保持在55%左右,以“手抓一把并緊握,無水滴落,松手后輕觸即散”為宜,一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異,在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患,要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響,通常夏季發酵2-3天,冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后,有較為強烈的酸香味,ph值在3-4。

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規模運用混合發酵現場

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塑料缸、飼料袋(有內膜)均可做發酵飼料

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采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是,發酵后的飼料酸度較低,不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況,將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中,發酵完成的棉菜粕為濕料,具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕(濕料)代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用,與其它飼料混合后直接飼喂,由于棉菜籽粕蛋白較高,最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%(濕料重量)。如果發現發酵飼料過酸適口性變差,可在飼喂前在陽光下曬1-2小時,或添加適量的碳酸氫鈉(小蘇打)即可改善。

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發酵過程中與發酵后使用過程中,發酵的容器要一直保持密封狀態,可以長時間保存(一年左右)。

當前養殖業成本高居不下,而飼料成本是其中最高的,利用廉價原料發酵飼料(包括一些輕度發霉的粕類低價收回)是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用,可以將輕度霉變飼料變成優質飼料,將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等,可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香,提高了飼料的適口性,加上發酵飼料中有大約4℃的酒度,能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病,是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕(餅)、棕櫚粕等,方法同上。

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