發酵飼料對生長育肥豬結腸微生物發酵及菌群組成的影響
生長育肥豬的健康狀況直接影響到豬生產的經濟效益。為改善豬體健康，傳統方法是在飼料中添加飼用抗生素來實現該目的，但隨著人們對飼用抗生素帶來的藥物殘留及生態安全等問題的認識的不斷深入，飼料中禁用飼用抗生素已是大勢所趨；發酵飼料作為一種綠色、環保的新型健康飼料，一定程度上可以減少飼用抗生素的使用，降低養殖成本，因而受到養殖界的廣泛關注。
豬后腸具有復雜的微生物菌群，這些微生物在維持動物機體健康、改善機體代謝及維持腸道穩態等方面起著重要作用。研究表明，使用發酵飼料可以減少腸道致病菌的定植，改善腸道健康，然而，目前仍不清楚使用發酵飼料對豬腸道菌群組成的具體影響，為闡明這一問題，本試驗以復合菌發酵飼料飼喂生長育肥豬，利用高通量測序手段研究了育肥豬結腸黏膜及其內容物中細菌菌群組成的變化，擬為生物發酵飼料在育肥豬中的合理應用提供理論依據。
1材料和方法
1.1試驗動物、試驗日糧與試驗設計
試驗于2017年4月–2017年5月進行，選用健康、日齡基本一致、體重約60 kg的杜×長×大三元雜交豬24頭，隨機分為2組，分別為基礎日糧組(對照組)、復合菌發酵飼料組(試驗組)，每組4個重復，每重復3頭豬。日糧配方及營養水平見表1。
復合菌發酵飼料的制作程序如下：采用南京農業大學動物科技學院消化道微生物實驗室保存的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液，并按質量比2：2：1進行混合（復合菌的總數量約為1×109 CFU/g），取對照組基礎日糧，按2 g/kg復合菌液添加于日糧中，調節飼料濕度為40%，混合均勻后分裝至單通閥發酵袋中，于37 °C發酵2天，飼喂前再與基礎日糧以1：4的比例混合，將混合飼料作為試驗組日糧。試驗期間，每日飼喂2次，自由采食，自動飲水。試驗期為30 d。
1.2 樣品采集與制備
于試驗正式開始后第30 天，每組每個重復隨機選擇一頭豬屠宰，屠宰后迅速取出整個消化道，分腸段進行結扎，結腸全部內容物迅速混勻后，測定內容物pH值，另取部分內容物按1：1的質量比與去離子水混合，5000 g下離心10 min后，一部分上清液凍存于-20 °C冰箱中用于乳酸濃度的測定，另一部分上清液中以5：1的比例加入25%（W/V）偏磷酸與巴豆酸混合液，混勻后凍存于-20 °C冰箱中用于揮發性脂肪酸濃度的測定；取部分樣品于-20 °C保存，用于細菌DNA提取；無菌剪刀剪取結腸中段，無菌冰磷酸緩沖液清洗干凈，采用無菌載玻片將黏膜和肌肉層分離開，刮取黏膜，樣品于-80 °C保存備用。
1.3 結腸內容物中pH、乳酸和揮發性脂肪酸的測定
采用固體pH計(HANNA，美國)測定結腸內容物pH，乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸測試盒測定。樣品解凍后，12000 g離心5 min，取0.3 μL上清液于GC-14B型氣相色譜儀(Shimadzu，日本)測定揮發性脂肪酸濃度。
1.4 結腸黏膜和內容物中DNA提取及MiSeq測序
選用美國MoBio公司PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit試劑盒對結腸黏膜樣本的基因組DNA進行提取；采用CTAB法提取結腸內容物中DNA，取0.3 g解凍的結腸內容物，加入2 mL磷酸緩沖液后渦旋混勻、12000′g離心，類似操作，清洗樣品2–3次。在所得沉淀中加入1 mL CTAB溶液，混勻后轉移至含有0.3 g滅菌鋯珠的鋯珠管中，采用珠磨儀(Biospec，美國)破碎細胞，再采用酚-氯仿-異戊醇提取結腸內容物中細菌總DNA。采用NanoDrop ND-2000 spectrophotometer (Thermo fisher，美國)測取DNA濃度。在Illumina (MiSeq)平臺進行DNA雙端測序。使用細菌16S rRNA基因的V4區作為模板，進行PCR擴增，引物序列為515F (5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3)和806R (5′-GGACTACCVGGGTATCTAAT-3′)。擴增條件為：95 °C 2 min；95 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 1 min，25個循環；72 °C 5 min。
1.5 生物信息學分析
根據Barcode的信息，將單個樣品數據拆分出來，刪除引物序列，進行測序序列質量控制，將不含樣品信息的序列、過短或過長的序列、出現ambiguous堿基及含有過多homologous堿基的序列去除；通過質量檢查的優質序列，應用QIIME (v.1.8.0)軟件進行分析處理，應用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3進行分類，使用SILVA數據庫(v.1.1.9)進行序列比對(alignment)，確定每條序列的分類等級。OTUs (operational taxonomic units，分類操作單元)劃分以序列相似性97%為標準。
1.6 多樣性分析
通過豐富度指數(Chao、Ace)、多樣性指數(Shannon、Simpson)對樣品中物種Alpha多樣性進行分析；采用隨機抽樣的方法抽取OTU數據，以抽到的序列數與它們所能代表的OTU數目構建曲線，即得稀疏曲線；基于OTU相對豐度對結腸黏膜及內容物樣本中菌落組成進行門水平、屬水平分析。
1.7 統計分析
試驗所得數據經Excel (2010)初步處理后，常規數據采用SPSS 20.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行分析，高通量測序結果采用Kruskal-Wallis進行非參數檢驗。顯著性水平(P值)置于0.05。
2生物發酵飼料的作用機理
2.1 結腸內容物中發酵參數的測定
表2為育肥豬結腸內容物中pH、乳酸及VFA濃度的測定，與對照組比較，采食20%復合菌發酵飼料的豬結腸內容物中僅丁酸水平顯著升高(P<0.05)，而兩組間在pH、乳酸、乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發性脂肪酸含量方面無顯著差異(P>0.05)。
2.2 結腸黏膜及內容物OTU水平分析
由圖1 可見，結腸黏膜(A)及內容物(B)的稀疏曲線顯示，隨著測序深度增加，曲線逐漸趨于平緩，說明測序數據量合理。
2.3 結腸黏膜及內容物細菌群落的多樣性分析
由表3可見，飼喂含發酵飼料的日糧對育肥豬結腸黏膜及內容物中細菌的OTU數量、ACE及Chao等特種豐度和多樣性指數并沒有顯著影響(P>0.05)。由圖2可見，PCA圖顯示，對照組與處理組兩組間均可明顯區分開，說明兩組菌群之間存在差異性。進一步AMOVA分析，顯示飼喂復合菌發酵飼料顯著影響了育肥豬結腸黏膜(Fs=2.19，P=0.025)和內容物(Fs=1.92，P=0.026)的細菌群落。
2.4 結腸黏膜及內容物細菌類群分析
Venn圖可反映樣本間及組間共有和特有的OTU數目，從而直觀地反映出樣本間及組間細菌菌群組成的重疊情況。圖3-A中可以看出結腸黏膜中共有的細菌OTU數目為411個，代表物種分別屬于腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯菌屬(Weissella)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等。其中，對照組獨有的細菌OTU分別屬于金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、乳桿菌目(Lactobacillales)；發酵飼料組獨有的細菌OTU分別屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯菌屬(Weissella)、綠膿桿菌屬(Pseudomonas)。
從圖3-B中可以看出，結腸內容物中共有的OTU數目為405個，代表物種分別屬于腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯菌屬(Weissella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)等。其中，對照組育肥豬結腸內容物中獨有的細菌OTU分別屬于黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、擬桿菌目(Bacteroidales)、密螺旋體屬(Treponema)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、乳桿菌目(Lactobacillales)；發酵飼料組獨有的細菌OTU分別屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、擬桿菌目(Bacteroidales)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯菌屬(Weissella)。
2.5 結腸細菌門水平分析
由圖4可見，育肥豬結腸黏膜細菌菌群中有16 個菌門，其中優勢菌門為厚壁菌門(46.13%)、變形菌門(31.55%)、擬桿菌門(10.94%)，在門豐度上，兩組之間未有顯著變化；在內容物中的細菌菌群共檢測到15個菌門，其中優勢菌門為厚壁菌門(52.32%)、變形菌門(37.52%)、擬桿菌門(3.25%)。與對照組比較，飼喂發酵飼料組的育肥豬結腸內容物中螺旋體菌門的相對豐度顯著升高(P<0.05)，但對其他菌門的豐度無顯著影響(P>0.05)。
2.6 結腸細菌屬水平分析
育肥豬結腸黏膜(圖5-A)及內容物(圖5-B)中細菌屬水平相對豐度如圖所示，育肥豬結腸內容物中共檢測到116個菌屬，以相對豐度0.5%為標準篩選出35個優勢菌屬，與對照組比較，發酵飼料組未分類菌屬、Subdoligranulum菌屬、脫硫弧菌屬和魏斯菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)。黏膜中共檢測到116個菌屬，以相對豐度0.5%為標準篩選出34個優勢菌屬，與對照組比較，發酵飼料組中的未分類菌屬、柔嫩梭菌屬和魏斯菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)。
2.7 結腸細菌群落的功能預測
利用PICRUSt作為一種預測工具對結腸黏膜及內容物中細菌功能進行預測，在所有樣品中，總共發現39個基因家族；通過對KEGG通路的PCA分析，顯示無論結腸黏膜還是內容物，兩組樣品之間未區分開，表明兩組之間的功能存在一定的相似性(圖6)。這些基因家族中，大部分基因與膜轉運(對照組在黏膜中為11.92%，內容物中為11.62%；試驗組分別為11.72%，11.78%)、碳水化合物代謝(對照組在黏膜和內容物中分別為9.80%，10.13%；試驗組分別為9.85%，10.13%)、氨基酸代謝(對照組在黏膜和內容物中分別為9.61%，9.72%；試驗組分別為9.63%，9.68%)相關。在所有基因家族中，結腸黏膜細菌中，涉及免疫系統(P=0.021)和翻譯(P=0.021)的基因家族的相對豐度顯著高于對照組，而有關復制和修復(P=0.043)、膜轉運(P=0.04)的基因家族相對豐度顯著低于對照組；在結腸內容物細菌菌群中，飼喂發酵飼料組的細菌菌群中有關遺傳信息處理(P=0.021)的基因家族相對豐度顯著高于對照組，而有關免疫系統疾病(P=0.021)和神經系統(P=0.043)的基因家族相對豐度顯著低于對照組。
3討 論
消化道微生態是豬機體最為重要和復雜的微生態系統之一，其中菌群的數量及種類可隨著機體的生長發育而不斷發生變化，維持一種復雜的動態平衡，在長期進化過程中，豬消化道微生態與宿主形成了互利共生的關系。豬微生物消化的主要場所位于消化道后段，胃和小腸未吸收的營養素進入后腸，經微生物進一步發酵，發酵產物可被吸收，進入機體起到供能及調控宿主代謝與免疫的作用。本實驗發現，飼喂含發酵飼料的日糧的豬結腸中丁酸含量顯著升高，由于丁酸是動物體內腸上皮細胞組織再生和修復的主要營養物質，其還可抑制腸道內的病原菌或腐敗菌生長，促進益生菌的發育和增殖；此外，已有研究表明，丁酸還可通過多種途徑影響結腸屏障功能，改善結腸上皮細胞防御功能，緩解腸炎。因此，發酵飼料組豬結腸中丁酸含量升高，說明飼喂發酵飼料有利于豬后腸道健康。
本試驗在育肥豬結腸黏膜中檢測到16個菌門和116個菌屬，內容物中共檢測到15個菌門和116個菌屬。在門水平上，本研究發現，厚壁菌門和擬桿菌門是結腸黏膜及內容物中相對豐度最高的兩個細菌門類，目前關于這類細菌的主要生理功能的研究顯示，這兩個菌門主要參與日糧中多糖物質和蛋白質降解。同時，有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道細菌中主要的菌門，因此，在豬結腸黏膜及內容物中，厚壁菌門和擬桿菌門在結腸微生物發酵及微生態平衡中起著關鍵作用。在屬水平上，本研究發現，柔嫩梭菌是厚壁菌門的主要成員之一，前人研究表明，該類細菌菌群可利用底物中的纖維素發酵產生包含丁酸在內的多種揮發性脂肪酸，Subdoligranulum菌屬是柔嫩梭菌屬的一個亞屬，其特性與柔嫩梭菌屬相似。本試驗中，試驗組育肥豬結腸黏膜中柔嫩梭菌屬和內容物中Subdoligranulum菌屬相對豐度顯著升高，由于柔嫩梭菌屬和Subdoligranulum菌屬為丁酸產生菌，其相對豐度升高會導致結腸中丁酸水平上升，該結果也與發酵飼料組結腸內容物中丁酸水平顯著升高相印證。
豬腸道黏膜菌群是一類主要定植在豬腸道黏膜上的微生物，這類微生物菌群可形成生物膜，起到微生物屏障作用。有研究顯示，宿主腸道內微生物屏障可阻礙病原菌在腸壁上的定植，并可促進腸黏膜細胞增殖，增強機體的免疫機能。而一旦腸道菌群與宿主間的動態平衡被打破，致病菌可大量增殖，就有可能導致各類疾病的發生。魏斯菌屬是乳酸菌的一種，有研究表明，魏斯菌屬對多種革蘭氏陽性和陰性菌有抑制作用，魏斯菌屬可產生一種葡聚糖，促進有益菌如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的生長。本試驗中，試驗組育肥豬結腸內容物中魏斯菌屬的相對豐度顯著升高，該結果說明，日糧中添加發酵飼料有利于改善豬結腸的菌群結構。同時，本研究在發酵飼料組豬結腸中檢測到大量有益菌如葡糖桿菌和醋酸桿菌，而一些在對照組豬結腸中檢測到的致病菌如密螺旋體屬、產吲哚金黃桿菌等并未在發酵飼料豬結腸黏膜上檢測到；這些結果進一步說明，飼喂復合菌發酵飼料可增加育肥豬結腸黏膜上有益菌數量，抑制有害菌增殖。
相關研究表明，腸道細菌對維持機體代謝與健康起著重要作用，本試驗應用PICRUSt軟件預測了育肥豬結腸黏膜和內容物上附著細菌的潛在功能。結果顯示，飼喂發酵飼料組的育肥豬結腸黏膜及內容物中細菌菌群的潛在功能與對照組之間皆存在顯著差異，說明細菌群落的改變可能會導致其功能的改變。與對照組比較，試驗組育肥豬結腸有關免疫系統的細菌基因豐度增多，而有關免疫系統疾病的細菌基因比例減少，結果說明，飼喂復合菌發酵飼料可改善育肥豬后腸健康；此外，試驗組育肥豬結腸中有關遺傳信息處理及翻譯的細菌基因的百分比升高，這說明飼喂復合菌發酵飼料后，腸道細菌可能對自身遺傳信息的表達能力增強，從而增強其活性。
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