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羊肉蛋白酶解及酶解液中氨基酸成分的研究表明提升食用口感,促進(jìn)肌肉增長(zhǎng)、機(jī)體發(fā)育

2022-06-01 12:21:44      點(diǎn)擊:

摘要:為了探究高效的羊肉蛋白的酶解工藝以及酶解液中氨基酸種類與含量,試驗(yàn)采用凍干羊肉粉為原材料,以酶解液中氨基酸肽氮的含量為水解度的評(píng)價(jià)指標(biāo),選擇堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加總量和添加比例、羊肉蛋白含量、酶解溫度、pH值以及酶解時(shí)間為自變量進(jìn)行單因素試驗(yàn),篩選部分因素進(jìn)行五因素三水平的正交試驗(yàn),同時(shí)測(cè)定最終酶解液游離氨基酸的種類與含量。結(jié)果表明:最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量為5%、添加比例為1:3,酶解溫度為50℃, pH值為8.0,羊肉蛋白含量為4%,酶解時(shí)間為8h,在該條件下復(fù)合酶對(duì)羊肉蛋白水解度為43.7% 。酶解液中有20種氨基酸,總含量為1 288.98 mg / 100mL;游離氨基酸含量分為4個(gè)區(qū)段,其中亮氨酸含量最高(214.42 mg/100mL),色氨酸含量最低(8.63 mg /100mL)。說(shuō)明優(yōu)化后的酶解工藝合理可行,且具有較好的酶解效果以及較低的時(shí)間成本。

我國(guó)是羊肉生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó),2017年,我國(guó)羊肉年生產(chǎn)總量為467. 5萬(wàn)t,年人均羊肉消費(fèi)量為3. 5 kg,在所有肉類消費(fèi)中羊肉占比超過(guò)5% 。目前,我國(guó)肉羊的屠宰及初加工場(chǎng)區(qū)大多在牧草豐富的西北地區(qū),由于當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)水平及監(jiān)管、規(guī)范力度相對(duì)不足,使得肉羊屠宰初加工中產(chǎn)生大量的屠宰副產(chǎn)品無(wú)法得到有效的利用,肉羊屠宰副產(chǎn)品的處理多采用酶解法、化制法以及微生物發(fā)酵法等。目前,對(duì)于肉羊屠宰副產(chǎn)品處理的研究主要集中于骨、血液、內(nèi)臟以及油脂等副產(chǎn)品,其處理產(chǎn)物多用于制備工業(yè)油、骨粉、肥料以及燃料等。在眾多處理方法中,酶解法是最為環(huán)保、安全的方法,其中單一酶解法的酶解效果普遍較差,因此復(fù)合酶解法成為了常用的酶解方法之一。酶解法中常用的酶有堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶以及菠蘿蛋白酶等。研究結(jié)果表明,木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶常用于植物的酶解及肉的嫩化,木瓜蛋白酶對(duì)蛋白胨的酶解效果較差,菠蘿蛋白酶在水中溶解度較低且對(duì)肌纖維蛋白原酶解效果較差;堿性蛋白酶對(duì)肽鍵、酰胺鍵以及酯鍵等均有良好的水解效果;風(fēng)味蛋白酶具有改善酶解產(chǎn)品質(zhì)量、降低成本及提高水解度等優(yōu)點(diǎn),因此常用于骨/肉副產(chǎn)品加工等領(lǐng)域。綜上所述,本試驗(yàn)提出利用堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶對(duì)羊肉的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化探究,選出最優(yōu)酶解條件并測(cè)定酶解液中氨基酸的含量,為其在氨基酸有機(jī)肥以及飼料添加劑等方面的應(yīng)用提供參考,以及為屠宰副產(chǎn)品的高價(jià)值二次利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1供試羊肉樣品與酶類

羊肉樣品為蘭州大尾羊屠宰過(guò)程中產(chǎn)生的碎肉殘?jiān)商m州市忠華屠宰場(chǎng)提供。堿性蛋白酶(40萬(wàn)μ/g)、風(fēng)味蛋白酶(20萬(wàn)μ/g)。

1.2主要試劑與儀器

甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯乙酸、茚三酮(均為分析純)

2、方法

2.1羊肉樣品前處理與其蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

用絞肉機(jī)攪碎肉樣后,將其置于真空冷凍干燥機(jī)中,-40℃下冷凍干燥36 h,取出后罐裝密封保存,備用。參照《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》(GB 5009. 5-2016)中的凱氏定氮法測(cè)定肉樣中蛋白質(zhì)含量。

2.2單因素試驗(yàn)及酶解體系

2.2.1單因素試驗(yàn)探究

堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量(1%、2%、3%、4%、5%)、堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加比例(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)羊肉蛋白含量(4%、5%、6%、7%、8%),pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、酶解溫度(40,45,50,55,60℃),酶解時(shí)間(2,4,6,8,10 h)對(duì)羊肉樣品蛋白質(zhì)水解度的影響。參照《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》(GB 5009. 235-2016)中的甲醛滴定法測(cè)定肉樣蛋白質(zhì)水解度。

2. 2. 2酶解體系

在500mL錐形瓶中加入100mL純化水,再按照計(jì)算公式加入凍干羊肉粉(計(jì)算公式:W1= W2/N,W1為加入凍干羊肉粉量;W2為所需粗蛋白量;N為測(cè)得凍干羊肉粉中粗蛋白的含量),然后加入不同比例的堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶(加入量按占凍干羊肉粉中粗蛋白量的百分比計(jì)算),用0.05mol/L鹽酸與0. 05mol/L氫氧化鈉調(diào)整酶解體系pH值,之后將酶解體系放入恒溫?fù)u床定時(shí)反應(yīng),每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)5次。

2. 3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo),以酶解溫度、pH值、羊肉蛋白含量、堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加量、堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加比例為考察因素,設(shè)計(jì)L18(35)正交試驗(yàn),優(yōu)化酶解工藝,利用SPSS 22.0軟件進(jìn)一步對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)中得到的最佳水解條件,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.5羊肉樣品酶解液中氨基酸含量的測(cè)定

按照最佳酶解條件將羊肉樣品酶解后,取酶解液置于100℃水浴中滅活15 min,待酶解液冷卻后用紗布粗濾,然后將樣品經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后靜置20 min,再向1mL酶解液中加入0.25mL的20%三氯乙酸,混勻后4℃過(guò)夜。取過(guò)夜酶解液樣品上清液用0.22μm膜過(guò)濾并稀釋20倍后,使用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行酶解液樣品中氨基酸含量的測(cè)定。

2.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22. 0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果均以“平均值士標(biāo)準(zhǔn)差”表示,對(duì)單因素試驗(yàn)采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,正交試驗(yàn)結(jié)果采用多因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著。

3、結(jié)果與分析

3.1羊肉樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定干燥后的羊肉樣品中粗蛋白含量為77.4%。

3.2單因素試驗(yàn)

3.2.1堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量對(duì)羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

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 由圖1可知,隨著堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量的增加,肉樣中蛋白質(zhì)的水解度呈先上升后略微下降的趨勢(shì),在添加量為4%時(shí),水解度最大(36.7%),且與1%、2%、3%添加量差異顯著(P

3.2.2堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加比例對(duì)羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知,在堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加比例為1:2時(shí),羊肉樣品的蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大值(36.8%),且較其他各個(gè)添加比例差異顯著(P<0.05),之后隨著比例升高,羊肉樣品的蛋白質(zhì)水解度逐漸下降,綜合考慮選擇復(fù)合酶添加比例1 :1,1:2,1:3進(jìn)一步優(yōu)化。

3.2.3羊肉蛋白含量對(duì)羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

在酶濃度保持不變的條件下,一定范圍內(nèi),酶促反應(yīng)速率與底物濃度呈正比。由圖3可知,當(dāng)羊肉蛋白含量為5%時(shí),羊肉樣品蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大值(39.5%),且與其他各濃度差異顯著(P<0.05),之后隨著羊肉蛋白含量的升高,羊肉樣品中蛋白質(zhì)的水解度逐漸下降,綜合考慮選擇底物濃度4%、5%、6%進(jìn)一步優(yōu)化。

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3. 2. 4  pH值對(duì)羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

 由圖4可知,pH值較低時(shí),羊肉樣品蛋白質(zhì)水解度隨著pH值升高不斷上升,在pH值為7. 5時(shí)達(dá)到峰值(41.9%),之后隨著pH值升高水解度逐漸下降,綜合考慮選擇pH值7.0、7.5、8.0進(jìn)一步優(yōu)化。

3.2.5酶解溫度對(duì)羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知,當(dāng)溫度為50℃時(shí),羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大值(40.9%),且較其他各溫度均差異顯著(P<0.05),之后隨著溫度的升高水解度逐漸下降,綜合考慮選擇溫度45,50,55℃進(jìn)一步優(yōu)化。

3.2.6酶解時(shí)間對(duì)羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度的影響

由圖6可知:酶解時(shí)間8h內(nèi),隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),羊肉樣品中蛋白質(zhì)水解度較快上升,且各個(gè)時(shí)間段水解度均差異顯著(P

3. 3正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以羊肉樣品中蛋白質(zhì)的水解度作為指標(biāo),選擇堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加總量和添加比例、羊肉蛋白含量、酶解溫度、pH值為自變量,進(jìn)行五因素三水平的正交試驗(yàn),設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1~3。

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由表2可知,各因素對(duì)于酶解效果的影響程度為A>C>B>E>D,即堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量>酶解溫度>堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的添加比例>羊肉蛋白含量>pH值,酶解最佳工藝為A3B3C2D3E1,即堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量5%、添加比例1:3,酶解溫度50℃ pH值8.0,羊肉蛋白含量4%。

由表3可知,因素A即堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)酶解工藝影響極顯著(P<0.05),因素C即酶解溫度對(duì)酶解工藝影響顯著(P<0.05),說(shuō)明復(fù)合酶添加量與酶解溫度在酶解反應(yīng)中有重要作用。

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3. 4驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)中得到的最佳水解條件,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果表明,在最佳水解條件下(A3B3C2D3E1)得到的水解度為43.7%,高于正交試驗(yàn)中的最高值42.8%,表明本研究的酶解工藝具有較高的可行性。故確定復(fù)合酶對(duì)羊肉樣品蛋白質(zhì)的最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加量5%、添加比例1:3,酶解溫度50℃ pH值8.0,羊肉蛋白含量4%,酶解時(shí)間8 h。

3. 5酶解液中游離氨基酸種類和含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

3. 4驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)中得到的最佳水解條件,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果表明,在最佳水解條件下(A3B3C2D3E1)得到的水解度為43.7%,高于正交試驗(yàn)中的最高值42.8%,表明本研究的酶解工藝具有較高的可行性。故確定復(fù)合酶對(duì)羊肉樣品蛋白質(zhì)的最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加量5%、添加比例1:3,酶解溫度50℃ pH值8.0,羊肉蛋白含量4%,酶解時(shí)間8 h。

3. 5酶解液中游離氨基酸種類和含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

4、討論

我國(guó)肉羊的飼養(yǎng)量及羊肉產(chǎn)量均居世界首位,但目前對(duì)其屠宰產(chǎn)生的副產(chǎn)品,尤其是碎肉渣的處理能力相對(duì)不足,通常是與其他副產(chǎn)品混合處理,使得碎肉渣的二次利用價(jià)值沒(méi)有充分開(kāi)發(fā)。因此,本試驗(yàn)提出利用復(fù)合酶酶解技術(shù)對(duì)肉羊屠宰產(chǎn)生的肉殘?jiān)M(jìn)行酶解處理,在酶促反應(yīng)中,酶的催化活性受到眾多因素的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)復(fù)合酶的添加量達(dá)

到5%時(shí),水解度略微下降,說(shuō)明在底物一定的情況下,過(guò)量添加蛋白酶的量,會(huì)導(dǎo)致酶分子與底物分子結(jié)合相對(duì)困難,使得水解度出現(xiàn)略微下降趨勢(shì)。同時(shí),本試驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)合酶比例超過(guò)1:2且隨著風(fēng)味蛋白酶比例的增加,水解度出現(xiàn)明顯的下降,這可能與堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶切位點(diǎn)不同有關(guān),堿性蛋白酶對(duì)肽鍵、酰胺鍵以及酯鍵等均有良好的水解效果,能更大程度將蛋白質(zhì)水解為大分子肽段,而風(fēng)味蛋白酶僅對(duì)肽鍵有較好的水解效果,因此隨著風(fēng)味蛋白酶添加比例的增加,水解度有一定程度的下降。

另外,酶促反應(yīng)體系中,底物蛋白質(zhì)含量、pH值、酶解溫度、時(shí)間等均會(huì)影響酶的催化活性。底物羊肉蛋白的含量過(guò)高,會(huì)增大水解液的黏稠程度,導(dǎo)致蛋白酶在水解液中分布不均,抑制水解反應(yīng)的進(jìn)行,且過(guò)量的底物與酶分子結(jié)合,生成無(wú)活性的中間產(chǎn)物,會(huì)影響酶的活性。過(guò)高的pH值會(huì)改變酶分子與底物分子的帶電狀態(tài),從而降低酶與底物的結(jié)合效率。溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響酶的活性,溫度過(guò)低不僅影響酶活,還會(huì)使得酶與底物結(jié)合效率降低,抑制酶促反應(yīng)速率,溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的破壞。長(zhǎng)時(shí)間的酶促反應(yīng)可使反應(yīng)體系逐漸飽和,另一方面,水解產(chǎn)物使反應(yīng)體系的pH值逐漸下降,酶的活性可受到一定程度的影響。因此,本試驗(yàn)探究了復(fù)合酶對(duì)羊肉蛋白質(zhì)最佳的酶解條件,使羊肉蛋白質(zhì)最大程度水解為小分子肽以及氨基酸。本試驗(yàn)結(jié)果表明,為保證高水解度低成本的效果,羊肉酶解工藝最佳條件為堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量5%和添加比例1:3,酶解溫度50℃, pH值8.0、羊肉蛋白含量4%,酶解時(shí)間8h,在此條件下水解度可達(dá)43.7%。  

 本試驗(yàn)對(duì)酶解產(chǎn)物中的氨基酸種類與含量進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物中含有20種氨基酸,其中亮氨酸與谷氨酸含量顯著高于其他氨基酸,異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸及天冬氨酸為中等含量,而色氨酸含量最低。可見(jiàn)羊肉酶解液中支鏈氨基酸與必需氨基酸含量較高,但支鏈氨基酸含量過(guò)高會(huì)帶來(lái)較差的食用感受,而酶解物中較高含量的谷氨酸可以大幅度提升食用口感。大量研究結(jié)果表明,支鏈氨基酸作用較為廣闊,是動(dòng)物飼料添加劑研究的重點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn),仔雞日糧中添加亮氨酸以及異亮氨酸后,仔雞肌肉增長(zhǎng)率顯著上升,同時(shí)大幅度提高仔雞生長(zhǎng)性能。研究結(jié)果表明,日糧中添加低劑量的支鏈氨基酸可以顯著減少豬腸道中以及糞便中鏈球菌和銅綠假單胞菌的含量。研究發(fā)現(xiàn),增加日糧中支鏈氨基酸水平能降低肉雞料重比,適宜含量的支鏈氨基酸能促進(jìn)肉雞腸道生長(zhǎng)發(fā)育。研究結(jié)果表明,日糧中合理添加氨基酸能顯著提高育肥豬的生長(zhǎng)性能,有效改善育肥豬機(jī)體的免疫能力,縮短育肥周期。說(shuō)明支鏈氨基酸在促進(jìn)肌肉增長(zhǎng)、抗疲勞、抗肌肉損傷、促進(jìn)機(jī)體發(fā)育、調(diào)整能量和微生物平衡等方面有著重要作用。由此可見(jiàn),動(dòng)物屠宰副產(chǎn)品水解產(chǎn)物的二次利用具有廣闊的應(yīng)用前景。

5、結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化肉羊屠宰廢棄碎肉復(fù)合酶酶解工藝,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳酶解工藝為堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶添加總量5%和添加比例1:3,酶解溫度50℃,pH值8.0、羊肉蛋白含量4%,酶解時(shí)間8h。實(shí)際水解度為43.7%,高于正交試驗(yàn)中的最高值42.8%。對(duì)羊肉氨基酸組成的研究結(jié)果表明,羊肉酶解液中含有20種氨基酸,支鏈氨基酸與必需氨基含量豐富,且有較高含量的谷氨酸,使得羊肉及其酶解產(chǎn)物具有非常鮮美的食用感受,因此表明羊肉酶解產(chǎn)物在氨基酸肥料、動(dòng)物飼料添加劑等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

肉羊旺長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)素——使用前后能夠直觀看到健康程度提升與增長(zhǎng)增重加快

【原料組成】嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌、復(fù)合氨基酸(過(guò)瘤胃賴氨酸和蛋氨酸)、多種維生素、微量元素、復(fù)合酶制劑、免疫增強(qiáng)劑等。

【產(chǎn)品成分分析保證值】嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌等合計(jì)≥10cfu/g,維生素A150-250KIU,維生素D320-60 KIU,維生素E500IU,煙酰胺≥430mg,生物素≥0.4mg,鐵1.0-3.0g,銅0.20-0.62g 1.25-3.75g,錳0.75-3.0g,碘5-100g,硒2.0-12.5g,鈷2-50g,鈣10-20,總磷3.0 ,食鹽10-20,水分<9.0%

凈重:1000 /袋。

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5.本產(chǎn)品是一般的羊預(yù)混料的升級(jí)產(chǎn)品,增加了氨基酸、益生菌、酶制劑、免疫增強(qiáng)劑等,比一般預(yù)混料效果突出。且產(chǎn)品中不含任何動(dòng)物源性原料、無(wú)抗生素和其它違禁添加物,可以放心使用!

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2020年已全面禁抗,我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長(zhǎng)行為將是違法,否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)又能夠形成無(wú)抗養(yǎng)殖呢?其實(shí)中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長(zhǎng)、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為,特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處,這個(gè)實(shí)施方案比你想象中效果更好,運(yùn)用的沒(méi)有不被效果折服的,值得嘗試驗(yàn)證

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