釀酒酵母培養(yǎng)物替代抗生素對(duì)斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率及盲腸微生物區(qū)系的影響
抗生素的使用促進(jìn)了動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高，降低了仔豬腹瀉率。但與此同時(shí)也導(dǎo)致微生物耐藥性、食品藥物殘留、環(huán)境污染等問題。國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后禁止了洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星以及硫酸黏菌素在動(dòng)物中的應(yīng)用。目前國內(nèi)在積極進(jìn)行抗生素替代物的研究。釀酒酵母培養(yǎng)物相比于抗生素具有安全無毒、無殘留、無污染的特點(diǎn)，其成分復(fù)雜，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以優(yōu)化飼料營養(yǎng)價(jià)值，提高飼料養(yǎng)分消化率，具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)免疫力的功能。釀酒酵母培養(yǎng)物主要成分是酵母細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物，其中含有大量寡糖、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、維生素及酵母來源的酶。目前釀酒酵母培養(yǎng)物在仔豬上的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。有研究表明，在仔豬飼糧中添加酵母培養(yǎng)物可以顯著提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，改善仔豬腸道環(huán)境，降低仔豬腹瀉率，增加腸道有益菌的數(shù)量，降低腸道有害菌的數(shù)量，同時(shí)提高仔豬飼糧中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣和磷的表觀消化率，并確定了釀酒酵母培養(yǎng)物在仔豬中的最適添加量為5 kg /t 。但是目前國內(nèi)對(duì)于釀酒酵母培養(yǎng)物替代抗生素在仔豬上的應(yīng)用效果的研究較少。本文探究釀酒酵母培養(yǎng)物替代抗生素對(duì)斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率以及腸道微生物區(qū)系的影響，為釀酒酵母培養(yǎng)物替代抗生素在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1 分析方法
1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選擇體重相近的 28日齡的斷奶仔豬 180 頭，隨機(jī)分成 3 個(gè)組，每組 4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 15 頭仔豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧為參照 NＲC(2012)豬(10～20 kg)營養(yǎng)需要配制的顆粒狀配合飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表 1;抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加 75 g /t 金霉素 +50 g /t 吉他霉素 +10 g /t 維吉尼亞霉素;釀酒酵母培養(yǎng)物組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加 5 kg /t 的釀酒酵母培養(yǎng)物，釀酒酵母培養(yǎng)物由河南邑鴻善成生物技術(shù)有限公司提供。
1.2 飼養(yǎng)管理
試驗(yàn)開始前對(duì)空豬舍進(jìn)行清掃消毒，仔豬在28 日齡斷奶后稱重分組轉(zhuǎn)到保育舍，試驗(yàn)正式開始，試驗(yàn)期 38 d。飼喂采用自由采食的方式，每天08:30、14:00 和 18:00 上料，上料量隨仔豬日齡逐漸增加，保證料槽不空料。試驗(yàn)期間仔豬采用自動(dòng)飲水器自由飲水。每周一、周四進(jìn)行豬舍消毒，每周一、周四、周日進(jìn)行衛(wèi)生大清掃，每天 09:00-16:00 開窗通風(fēng)換氣，舍內(nèi)裝有地暖以及保溫?zé)簦瑢⑸醿?nèi)溫度控制在 20 ℃ 以上。每天 08:00 觀察仔豬糞便腹瀉情況。其他日常管理按豬場(chǎng)常規(guī)要求進(jìn)行。
1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法
1.3.1 生長性能
飼養(yǎng)試驗(yàn)期間，于試驗(yàn)第 1 天和最后 1 天對(duì)每重復(fù)仔豬空腹 16 h 后稱重，以重復(fù)為單位記錄試驗(yàn)期 間 仔 豬 的 總 采 食 量，計(jì) 算 平 均 日 采 食 量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
腹瀉率:每天 08:00 觀察仔豬糞便情況，統(tǒng)計(jì)每天腹瀉仔豬頭數(shù)，計(jì)算腹瀉率。
腹瀉率(%)= 腹瀉仔豬數(shù) × 腹瀉天數(shù)/(仔豬總數(shù) × 試驗(yàn)總天數(shù))。
1.3.2 養(yǎng)分消化率
采用內(nèi)源指示劑法，測(cè)定飼糧和糞中酸不溶灰分含量，以重復(fù)為單位，于試驗(yàn)第30天開始連續(xù)3 d采集新鮮無污染糞樣以及飼糧樣品，測(cè)定粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣和磷的表觀消化率。
1.3.3 盲腸微生物區(qū)系
于飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束的第 2 天每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1 頭健康仔豬進(jìn)行屠宰，取盲腸內(nèi)容物于 －80 ℃冰箱保存。采用 DNA 試劑盒提取樣品總 DNA 后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到的引物，擴(kuò)增 16S rＲNA 基因V3～V4 可變區(qū)，用 Illumina HiSeq 2500 進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads)。使用 FLASH 軟 件，通 過 overlap 對(duì) 每 個(gè) 樣 品 的reads 進(jìn)行拼接。使用 Trimmomatic 軟件，對(duì)拼接得到的 Ｒaw Tags 進(jìn)行過濾。使用 QIIME 軟件中的 UCLUST 對(duì) Tags 在 97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得操作分類單元(OTU)，并基于 Silva(細(xì)菌)和 UNITE(真菌) 分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì) OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋。將 OTU 的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)可得到每個(gè) OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在門和屬水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，繪制成物種組成柱狀圖。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析
采用 SPSS 17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果 以 平 均 值 ± 標(biāo) 準(zhǔn) 差 的 形 式 表 示。采 用ANOVA 程序?qū)υ囼?yàn)結(jié) 果 進(jìn) 行 方 差 分 析，采 用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。
2結(jié) 果 2.1 釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響 由表 2 可知，抗生素組平均日采食量最高，對(duì)照組平均日采食量最低，但是 3 組之間無顯著性差異(P＞0.05);抗生素組和釀酒酵母培養(yǎng)物組平均日增重均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但這 2 組之間沒有顯著性差異(P＞0.05);抗生素組和釀酒酵母培養(yǎng)物組料重比及腹瀉率均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，但這 2 組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。
2.3.2 釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物門水平物種組成的影響
由圖 2 可知，3 組在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群組成沒有差異，3 組的主菌群相同，依次是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria) 和放線菌門(Actinobacteria) 這四大菌門。其中釀酒酵母培養(yǎng)物組在門水平的 4 種優(yōu)勢(shì)菌的總相對(duì)豐度最高，達(dá)到了 99.60%，對(duì)照組的最低為 97.51%;釀酒酵母培養(yǎng)物組的四大主菌群的總相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P＜0.05)。由圖 3 可知，3 組中釀酒酵母培養(yǎng)物組的螺旋體門(Spirochaeates) 相對(duì)豐度最低為0.18%，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，與抗生素組相比有降低的趨勢(shì)(P=0.053)。對(duì)照組的螺旋體門相對(duì)豐度最高為 1.37%，與抗生素組相比有升高的趨 勢(shì) (P=0.059)。抗 生 素 組 的 衣 原 體 門(Chlamydiae)和軟壁菌門(Tenericutes) 相對(duì)豐度在 3 組中最高，顯著高于釀酒酵母培養(yǎng)物組和對(duì)照組(P＜0.05)。抗生素組、對(duì)照組和釀酒酵母培養(yǎng)物組在門水平上的第一大優(yōu)勢(shì)菌是厚壁菌門，相對(duì)豐度分別為 65.87%、65.05%和 61.63%，但 3組之間沒有顯著性差異(P＞0.05);3 組的第二大優(yōu)勢(shì)菌門是擬桿菌門，其中釀酒酵母培養(yǎng)物組相對(duì)豐度最大，達(dá)到 24.16%，抗生素組和對(duì)照組的相對(duì)豐度分別是 18.73%和 19.13%，但 3 組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。
2.3.3 釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物屬水平物種組成的影響
由圖 4 和圖 5 可知，在屬水平上優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生了改變，對(duì)照組的第一優(yōu)勢(shì)菌為瘤胃球菌科 UCG-005(Ｒuminococcaceae UCG-005)，且其相對(duì)豐度顯著高于抗生素組和釀酒酵母培養(yǎng)物組 (P＜0.05)。由圖 5 可知，與對(duì)照組相比，釀酒酵母培養(yǎng)物組和抗生素組克里斯滕森菌科 Ｒ-7 群(Chris-tensenellaceae Ｒ-7 group)、大腸埃希菌 － 志賀菌屬( Escherichia-Shigella )、 密 螺 旋 體 屬 2(Treponema 2)的相對(duì)豐度均顯著降低(P＜0.05)，且抗生素組與釀酒酵母培養(yǎng)物組之間沒有顯著性差異(P＞0.05);與對(duì)照組相比，釀酒酵母培養(yǎng)物組普雷沃氏菌屬 2(Prevotella 2)(P=0.064)、普雷沃氏菌屬 7(Prevotella 7)(P= 0.058)以及普雷沃氏菌屬 9(Prevotella 9)(P= 0.072)的相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì);與抗生素相比，釀酒酵母培養(yǎng)物組普雷沃氏菌屬 7 相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)(P=0.072)。
討 論
釀酒酵母培養(yǎng)物中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以提高動(dòng)物的生長性能。李曉研究發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中添加 0.5%的釀酒酵母培養(yǎng)物顯著提高了斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量。VanDer Peet-Schwering 等研究發(fā)現(xiàn)添加釀酒酵母培養(yǎng)物可以顯著提高斷奶仔豬的平均日增重，改善料重比。這與本研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)飼糧添加釀酒酵母培養(yǎng)物顯著提高了斷奶仔豬的平均日增重，改善了料重比。釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)生長性能的影響可能與釀酒酵母培養(yǎng)物的營養(yǎng)成分有關(guān)，釀酒酵母培養(yǎng)物提供了氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、維生素和有機(jī)酸等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)化了飼糧的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也提供了大量的消化酶，提高了飼糧的養(yǎng)分消化率，從而降低了料重比。Ignacio 等認(rèn)為釀酒酵母培養(yǎng)物中含有的醇類和酯類等芳香類物質(zhì)以及核苷酸、多肽等增味類物質(zhì)，可以改善飼糧的適口性，從而增加動(dòng)物的采食糧，有利用動(dòng)物日增重的提高。同時(shí)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧添加釀酒酵母培養(yǎng)物可以顯著降低仔豬的腹瀉率，這與郭小華等、何若鋼等的研究結(jié)果一致。不僅如此，Magalhaes 等給 70 日齡的荷斯坦?fàn)倥ｏ暭Z添加釀酒酵母培養(yǎng)物，結(jié)果改善了犢牛的腹瀉指數(shù)。釀酒酵母培養(yǎng)物可以降低腹瀉率，這可能與釀酒酵母培養(yǎng)物中的成分有關(guān)，釀酒酵母培養(yǎng)物中的有效成分包括酵母壁多糖，酵母壁多糖的主要成分是 β － 葡聚糖和甘露寡糖。Spring 等認(rèn)為釀酒酵母細(xì)胞壁成分中的甘露聚糖能夠刺激腸道中富含 D－ 甘露糖的接收器，該接收器能黏附具有傘狀菌毛的革蘭氏陰性菌如沙門氏菌;White 等認(rèn)為酵母細(xì)胞壁多糖能夠增強(qiáng)斷奶仔豬在感染大腸桿菌和沙門氏菌后的抵抗能力;而大腸桿菌和沙門氏菌是導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉的主要致病性微生物。
養(yǎng)分消化率體現(xiàn)的是動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力，動(dòng)物養(yǎng)分消化率的提高可以改善動(dòng)物的料重比。目前對(duì)于酵母培養(yǎng)物提高動(dòng)物養(yǎng)分消化率的研究結(jié)果不一致。劉學(xué)文等在斷奶羔羊飼糧中添加酵母培養(yǎng)物顯著提高了斷奶羔羊飼糧中粗蛋白質(zhì)消化率;王衛(wèi)正等在瀨兔飼糧中添加酵母培養(yǎng)物，結(jié)果顯著提高了斷奶瀨兔飼糧中粗蛋白質(zhì)的表觀消化率;張嘉琦等在蛋雞飼糧中添加 0.6%的酵母培養(yǎng)物，結(jié)果顯著提高了蛋雞飼糧中粗蛋白質(zhì)的表觀消化率;劉觀忠等在蛋雛雞飼糧中添加酵母培養(yǎng)物，結(jié)果提高了蛋雛雞飼糧中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷的表觀消化率;杜泓明研究發(fā)現(xiàn)添加酵母培養(yǎng)物顯著提高了斷奶仔豬飼糧中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和粗纖維的表觀消化率;而吳徐俊研究發(fā)現(xiàn)酵母培養(yǎng)物對(duì)斷奶仔豬飼糧中能量和粗蛋白質(zhì)表觀消化率沒有影響;張麗研究發(fā)現(xiàn)酵母培養(yǎng)物顯著降低了斷奶仔豬飼糧中粗蛋白質(zhì)、粗纖維、鈣和磷的表觀消化率。之所以出現(xiàn)這樣的情況，可能與生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物時(shí)選用的菌株不同及生產(chǎn)工藝不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示飼糧添加釀酒酵母培養(yǎng)物可以顯著提高斷奶仔豬飼糧中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷的表觀消化率。釀酒酵母培養(yǎng)物提高養(yǎng)分消化率可能由于釀酒酵母培養(yǎng)物中含有豐富的消化酶，這些消化酶可以補(bǔ)充斷奶仔豬剛斷奶時(shí)自身消化酶的不足，幫助仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化分解;并且釀酒酵母培養(yǎng)物中還含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，楊敏等認(rèn)為釀酒酵母培養(yǎng)物中的葡萄糖、植酸酶等成分可以提高磷的表觀消化率。
Chao 指數(shù)和 Ace 指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少;Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性，Shannon 指數(shù)值越大，Simpson 指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高，本試驗(yàn)結(jié)果顯示飼糧添加釀酒酵母培養(yǎng)物和抗生素對(duì)盲腸微生物的多樣性沒有顯著性影響。這與杜泓明的研究結(jié)果不一致，可能是由于酵母菌株以及飼養(yǎng)環(huán)境的不同導(dǎo)致的。本研究結(jié)果顯示釀酒酵母培養(yǎng)物組、對(duì)照組和抗生素組 3 組之間在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌組成沒有差異，但是盲腸微生物優(yōu)勢(shì)菌群的菌群豐度有影響，飼糧添加釀酒酵母培養(yǎng)物顯著降低了斷奶仔豬盲腸中螺旋體門的相對(duì)豐度。螺旋體門多為致病菌或條件致病菌，對(duì)仔豬腹瀉具有潛在的誘導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)，添加釀酒酵母培養(yǎng)物有提高普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度的趨勢(shì)。張麗萍等研究發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬與豬的脂肪率和背膘厚度呈現(xiàn)正相關(guān)。普雷沃氏菌屬可以分解纖維素產(chǎn)生脂肪酸，有利于仔豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，降低料重比。本研究還發(fā)現(xiàn)飼糧添加釀酒酵母培養(yǎng)物顯著降低了大腸埃希菌 － 志賀菌屬和密螺旋體屬 2 等腸道致病菌的相對(duì)豐度，而大腸埃希菌 － 志賀菌屬是仔豬腸道內(nèi)的潛在致病菌，能引起仔豬的腹瀉。釀酒酵母培養(yǎng)物能抑制有害菌的生長，這可能與釀酒酵母培養(yǎng)物中的酵母壁多糖成分有關(guān)。酵母壁多糖中的甘露寡糖和 β －葡聚糖可以抑制有害菌生長，甘露寡糖具有和動(dòng)物腸道黏膜上皮細(xì)胞特異性的寡糖受體相似的結(jié)構(gòu)，可以與致病菌的外源凝集素結(jié)合，將病原菌排出體外，從而阻止致病菌與腸道細(xì)胞的結(jié)合，保護(hù)斷奶仔豬腸道的健康，降低仔豬因?yàn)槟c道致病菌感染導(dǎo)致的腹瀉。
4結(jié) 論
① 釀酒酵母培養(yǎng)物提高了斷奶仔豬的生長性能和養(yǎng)分消化率，降低了斷奶仔豬的腹瀉率，達(dá)到了和抗生素相似的促生長效果。
② 釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物菌群的多樣性沒有影響，但是調(diào)節(jié)了斷奶仔豬盲腸微生物的菌群豐度，降低了腸道致病菌的豐度。
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