1.2 乳酸菌甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)特征

1.2.1 分離純化及分子量

LAB甘露聚糖酶多為胞外誘導(dǎo)酶，液體發(fā)酵液可通過離心或過濾除去菌體獲得粗酶液。甘露聚糖酶分離純化通常采用硫酸銨分級沉淀法、透析、超濾、離子交換及凝膠過濾等方法。張鑫等使用飽和度65%的硫酸銨沉淀L.casei HDS-01甘露聚糖酶蛋白，以CH3COO－為DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱洗脫陰離子，對甘露聚糖酶蛋白的洗脫效果最好，純化后甘露聚糖酶蛋白含量為4.93mg/mL，純化倍數(shù)提高了11.4倍。Nadaroglu等和Adiguzel等分別利用硫酸銨沉淀植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCCR14917TM、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）M17、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）M24和綠色魏斯氏菌（Weissellaviridescens）LB37的甘露聚糖酶蛋白時，飽和度為60%~80%，洗脫陰離子為Cl－，純化效率依次為74.5%、38.2%、75.6%和49.6%。結(jié)果表明，同種不同株來源的甘露聚糖酶在溶解度及陰離子相互吸附的能力上存在較大差別。

不同來源的甘露聚糖酶分子量也不盡相同，細(xì)菌來源的分子量通常在37~55kDa。環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）NT6.7和尼爾森桿菌（Bacillus nealsonii）甘露聚糖酶的分子量分別為40kDa和50kDa。真菌甘露聚糖酶的分子量一般較高，Chai等報道的綠木霉菌（Trichoderma virens）甘露聚糖酶分子量達(dá)到77kDa。LAB甘露聚糖酶的分子量通常為35~55kDa（表1）。L. plantarum M24有兩種甘露聚糖酶組分，分別為36.4kDa和55.3kDa。因此，LAB甘露聚糖酶的分子量與細(xì)菌的甘露聚糖酶較為相近，普遍小于真菌的甘露聚糖酶。

1.2.2 酶學(xué)特性

1.2.2.1 最適反應(yīng)pH值

細(xì)菌甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH值通常在略酸性到中性范圍（5.5~7.0）。真菌甘露聚糖酶作用范圍一般偏酸，最適反應(yīng)pH值為4.0~5.5，如里氏木霉（Trichoderma reesei）甘露聚糖酶的最適pH值為5.5。LAB中，P.acidilactici M17和W.viridescens LB37的甘露聚糖酶最適pH值均為6.0，而L.plantarum M24和L.plantarum ATCC®14917TM甘露聚糖酶的最適pH值分別為8.0和10.0。由此可以看出，LAB甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH值可以由弱酸性到堿性，與真菌來源的甘露聚糖酶相比，其作用pH值范圍更為寬泛。

1.2.2.2 最適反應(yīng)溫度

微生物甘露聚糖酶的最適作用溫度為40~65℃。W.viridescens LB37甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，且該酶在30~70℃時仍保持50%以上的活性。Nadaroglu等測定P.acidilactici M17甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，L.plantarum M24甘露聚糖酶的最適作用溫度和穩(wěn)定溫度范圍分別為50℃和30~70℃。L.casei HDS-01甘露聚糖酶酶活最適反應(yīng)溫度為40℃，然而當(dāng)溫度升至70℃時，相對酶活下降至30%以下，這是由于高溫環(huán)境破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋的結(jié)果。LAB甘露聚糖酶較為寬泛的作用溫度區(qū)間，提升了LAB甘露聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用中的潛力。

1.2.2.3 反應(yīng)熱動力學(xué)

微生物甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時，Km值通常為0.5～7.8 mg/mL，如密褐褶菌（Gloeophyllumtrabeum）CBS900.73（Km 3.7 mgmL−1，Vmax 2525 μmolmL−1·min−1）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）HJ14（7.8 mgmL−1，Vmax 270 μmolmL−1·min−1）。LAB甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時，Km值通常為0.01~0.59 mg/mL，如P.acidilactici M17（Km0.592mM，Vmax 78.74 mmolmin−1mg−1）、W.viridescens LB37（Km0.0178 mM, Vmax 82.5 mgmannan mL−1）和L.casei HDS-01（Km2.68 mgmL−1，Vmax400.03 μmolmL−1·min−1）。此外，L.casei HDS-01甘露聚糖酶以瓜爾膠為底物的相對活性比對槐豆膠、果膠和魔芋粉的相對活性高出1~2倍，并且發(fā)現(xiàn)瓜爾膠的高親和力和催化效率與其甘露糖和半乳糖較高比例（4：1）的組成是分不開的。

1.2.2.4 激活劑與抑制劑

金屬離子如Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+或Co2+等，對甘露聚糖酶有激活或抑制作用，同種金屬離子對不同來源的甘露聚糖酶產(chǎn)生的影響不同。Ca2+能夠抑制W.viridescens LB37與L.casei HDS-01甘露聚糖酶的活性，卻促進(jìn)枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilis subsp.inaquosorum）CSB31嗜堿性甘露聚糖酶的活性。Zn2+能夠與P.acidilactici M17和L.plantarum M24甘露聚糖酶的Zn2+結(jié)合位點結(jié)合，使酶活分別提高4%和286.3%。EDTA是一種金屬螯合劑，可以通過去除金屬離子以使酶失活。EDTA對L.caseiHDS-01甘露聚糖的酶活力有極強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)EDTA作用后剩余酶活僅在15%左右。不同來源的甘露聚糖酶性質(zhì)存在顯著差異，因此通過改變酶學(xué)性質(zhì)，使甘露聚糖酶達(dá)到最佳狀態(tài)，進(jìn)而擴(kuò)充LAB甘露聚糖酶的應(yīng)用范疇。

2LAB表達(dá)重組甘露聚糖酶

隨著對半纖維素資源的開發(fā)和功能性低聚糖MOS益生作用的研究，甘露聚糖酶的研究已取得較大程度的進(jìn)展，在保健品、飼料等行業(yè)廣泛應(yīng)用。LAB作為甘露聚糖酶的直接產(chǎn)酶菌株提供了諸多便利，具有食品安全級的保障和益生作用，符合綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展理念。為使LAB來源的甘露聚糖酶能夠更廣泛的應(yīng)用于工業(yè)化量產(chǎn)，需提高LAB甘露聚糖酶的環(huán)境適應(yīng)性、酶活力及產(chǎn)酶水平等。LAB甘露聚糖酶的研究將集中在以下幾個方面：第一，挖掘直接產(chǎn)甘露聚糖酶的LAB菌株資源，為酶的食品級應(yīng)用提供生成菌種；第二，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)；第三，利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)，提高甘露聚糖酶的安全性及產(chǎn)量。