發酵飼料中抑菌菌種篩選及抑菌性能評估方法的初步研究

2021-07-12 09:34:34 點擊：

摘要：試驗通過牛津杯法篩選出抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌性能較強的一株乳酸菌L3和兩株芽孢桿菌D9、K9。將其用于制作發酵飼料，提升發酵飼料的抑菌性能。試驗初步研究發酵飼料的體外抑菌性能評估方法。結果表明，用80%的乙醇溶液作為發酵飼料的前提取溶劑可增加抑菌物質的溶解，濃縮提取液的濃度可使發酵樣品的抑菌效果更加明顯。

對全國養殖業與飼料業而言，2020年是極其特殊又極具挑戰的一年。從年初非洲豬瘟的大面積爆發到農業農村部7月份明令叫停飼料企業對抗生素的生產和使用，這些現實與困難迫使人們從飼料配方到養殖模式都急需找到能替代抗生素的產品與技術。在此大背景下，人們把研究方向和重點轉向發酵飼料的優化升級，以此替代抗生素在飼料中的作用。對抗生素的依賴主要因其可通過抑止有害微生物的繁殖，進而維持動物機體健康，提高消化吸收利用率。發酵飼料正是通過菌酶協同等方式與致病菌競爭營養進而抑止有害微生物在動物體內定植，起到抗菌、防病的功能，還可調節機體腸道菌群平衡，改善腸道環境。

發酵飼料又稱微生物發酵飼料。可見，微生物在發酵飼料中起到至關重要的作用，菌種的選擇是發酵飼料品質的前提與關鍵。發酵飼料的優化從根本也是菌種的性能篩選與合理配伍。我國農業農村部在《飼料添加劑品種目錄》中規定在飼料中可用的微生物菌株達30余種。目前。發酵飼料使用的菌種主要以酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌為主。文章研究在發酵飼料常用菌中篩選出抑制以金黃色葡萄球菌與大腸桿菌為代表的致病菌性能較強的菌株，進而用篩選出的菌株優化提高發酵飼料的抑菌性能。近年來，許多學者對發酵菌種的單菌菌液抑菌能力評估深入研究，而對發酵飼料本身的抑菌性能評估方法及研究鮮少涉及。文章在采用瓊脂擴散牛津杯法評估發酵飼料的體外抑菌性能的基礎上優化測定方法，充分提取發酵飼料本身的抑菌物質，更大程度上體現出發酵飼料的抑菌性能，供廣大學者和飼料企業參考與使用。

1.材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

乳酸菌（1×1010CFU/g）：L1、L2、L3;芽孢桿菌（1×1011CFU/g）：K1、K3、K9、D1、D3、D9、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，以上菌種均為公司實驗室保藏菌種。

1.1.2 指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,S.a）ATCC26003、大腸桿菌（Escherichiacoli,E.coli）ATCC44102。

1.1.3 培養基及試劑

液體培養基：MRS液體培養基、營養肉湯培養基、LB液體培養基。平板培養基：LB固體培養基。

1.1.4 器皿及用品

三角瓶、直徑（90±0.1）mm的培養皿、1mL移液槍、100μL移液槍、內徑（6±0.1）mm的牛津杯、鑷子、無菌棉棒、游標卡尺等。

1.1.5 試驗儀器設備

光學顯微鏡（上海彼愛姆光學儀器制造有限公司）、高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）、冰箱（奧克斯集團有限公司）、氣浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）、生化培養箱（北京永光明醫療儀器有限公司）、旋轉蒸發儀（上海亞榮儀器有限公司）、干燥箱（北京永光明儀器有限公司）、分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］、高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械有限公司）、超凈工作臺［林茂科技（北京）有限公司］。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗菌液制備

乳酸菌菌液制備：取乳酸菌菌粉0.1g接種至150mLMRS液體培養基中，在生化培養箱37℃靜置培養24h后將菌液離心，10000r/min離心10min，取上清液備用。芽孢桿菌菌液制備：取芽孢桿菌菌粉0.1g接種至150mL營養肉湯培養基，37℃、140r/min搖床培養24h后將菌液離心，10000r/min離心10min，取上清液備用。

1.2.2 指示菌菌懸液制備

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種至LB液體培養基中，37℃過夜培養12~15h，顯微鏡下觀察活菌生長情況，將其稀釋至5×107CFU/mL菌懸液低溫備用。

1.2.3 指示菌平板的制備

涂布平板法：向已滅菌的培養皿中傾注20~25mL的LB固體培養基，水平靜置凝固，分別接種100μL金黃色葡萄球菌與大腸桿菌菌懸液，用棉棒涂布均勻后晾干低溫放置備用。

1.2.4 發酵菌種抑菌性能篩選

采用瓊脂擴散牛津杯法測定發酵菌種抑菌活性。將牛津杯垂直放于已制備好的兩種指示菌平板上，用鑷子輕壓使其與培養基表面緊密接觸，分別向牛津杯中加入200μL試驗菌種上清液，先室溫靜置1h后放于37℃生化培養箱培養12~18h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。每組測定兩個平行，最后結果取平均值。抑菌圈直徑越大，表明該菌種抑菌性能越強。

1.2.5 發酵飼料樣品的制備

將篩選出的抑菌性能較強的乳酸菌和芽孢桿菌按一定量混合成復合菌粉添加到飼料中，將復合菌粉與飼料原料混合，加入溫水制成水分為40%的樣品，40℃發酵4d，即為試驗發酵樣品。

1.2.6 發酵樣品抑菌性能評估方法

1.2.6.1發酵樣品浸提液的制備

準確稱取發酵樣品和飼料原料各100g，按照1:3體積比分別加入蒸餾水、80%無水乙醇、pH值7.5的緩沖溶液，在42℃，120r/min的條件下震蕩浸提3h，3 000r/min離心10min，收集上清液備用。

1.2.6.2發酵樣品浸提液的濃縮

取試驗組與對照組的上清液樣品各100mL，分別旋轉蒸發濃縮后定容至50 mL，濃縮液收集備用。

1.2.6.3發酵樣品抑菌性能評估

將用不同溶劑浸提的試驗組與對照組的浸提液與濃縮液用瓊脂擴散牛津杯法評估抑菌性能，方法同文章1.2.4。

2.結果與分析

2.1 發酵菌種抑菌性能篩選

2.1.1 乳酸菌抑菌性能評估（見圖1、表1）

由圖1、表1可知，3株乳酸菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，與楊柳等的研究結果相符。其中L3乳酸菌的抑菌效果最為明顯，產生的抑菌圈直徑最大，對大腸桿菌的抑菌圈直徑達1.96cm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為1.98 cm。因此，后期選擇L3乳酸菌作為制備抑菌發酵飼料的乳酸菌菌種。

2.1.2 芽孢桿菌抑菌性能評估（見圖2、表2）

由圖2、表2可知，芽孢桿菌對大腸桿菌均無抑制作用，D9、K1、K3、K9、Y4、Y5、Y6對金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，與陳潔梅等的研究結果相同，但與夏超篤等的研究結果不盡相同。這可能是因為芽孢桿菌屬所包括的菌種類別較多，特性差異較大。有研究表明，2013年農業農村部公布飼用芽孢桿菌共有6株，其中用于養殖飼料發酵的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌等。以上菌株雖同屬芽孢桿菌屬，但菌株特性不能一概而論，因此對不同致病菌的抑制能力也不盡相同。雖然Y4、Y5、Y6的抑菌圈直徑較大，但抑菌圈呈現半透明的狀態，表示其可能存在部分抑菌的可能性。因此選擇D9、K9作為制作發酵飼料的抑菌芽孢桿菌。

2.2 發酵飼料抑菌性能評估

2.2.1 不同提取溶劑對發酵飼料抑菌評估結果的影響（見圖3、表3）

關于發酵飼料的抑菌性能評估的資料大多是比較發酵飼料菌種的抑菌特性，而對發酵飼料本身的抑菌性能評估的相關研究較為少見。這是因為發酵飼料含有的抑菌物質復雜多樣，而且未有較為合適高效的提取方式，因此，文章重點對發酵飼料的前提取方式進行研究。

前期研究多種相關影響條件，如：前提取時間、溫度、稀釋比例等，但是均未能達到理想效果。結果發現提取效果最為明顯的因素是前提取溶劑的選擇。

由圖3可知，在相同條件下用蒸餾水、pH值7.5的緩沖溶液和80%的乙醇溶液對發酵樣品進行提取，抑菌結果有明顯差距。在前期試驗證實以上3種溶劑對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無明顯抑制作用，所以可排除溶劑對抑菌效果的影響。

由表3可知，用80%乙醇溶液作為前提取溶劑，發酵樣品的抑菌結果最佳。結果表明，發酵樣品中的抑菌物質可能更易溶解于有機溶劑。

2.2.2 前提取液濃度對發酵飼料抑菌評估結果的影響（見圖4、表4）

在選擇80%乙醇溶液作為前提取溶劑的基礎上，繼續研究提取液濃度對樣品抑菌性能的結果影響。由圖4、表4可知，使用旋轉蒸發儀對提取液進行濃縮對發酵樣品的抑菌結果有所提升，而且從試驗結果還可證明用乙醇溶液提取的飼料原料提取液同樣無抑菌作用，凸顯發酵飼料本身的抑菌優勢。

3.討論

文章通過比較實驗室保藏的多株益生菌種菌液的抑菌性能，用瓊脂擴散牛津杯法篩選出抑制金黃色葡萄球菌與大腸桿菌性能較強的一株乳酸菌L3和兩株芽孢桿菌K9、D9。用這3株抑菌菌種制成復合抑菌菌粉，用于優化發酵飼料的抑菌性能。為評估發酵飼料的抑菌性能，文章針對發酵飼料的體外抑菌評估方法進行細化研究。研究表明，發酵飼料前提取溶劑選擇對抑菌結果有明顯影響，并發現用80%的乙醇溶液作為溶劑更易于提取發酵飼料中的抑菌物質，而且通過旋轉蒸發濃縮提取液的濃度也可使發酵飼料的抑菌結果更為明顯。

在今年全面“禁抗”的大趨勢下，找尋抗生素替代品已是迫在眉睫。微生物發酵飼料的重要性也愈發凸顯，用發酵飼料替代抗生素在飼料中的作用已成為當下的研究熱點與主流。而發酵飼料的改進也不能停留在對抑菌菌種的篩選上，菌種間的協同配伍，酶制劑的合理使用都是后續需要深入研究的方向。體外抑菌評估方法還需進一步細化完善，要分清不同發酵飼料中抑菌物質的組成，才能針對性地選擇更加合理的評估方式，將發酵飼料本身的抑菌性能完全展現。

4.結論

文章用瓊脂擴散牛津杯法篩選出抑制金黃色葡萄球菌與大腸桿菌性能較強的一株乳酸菌L3和兩株芽孢桿菌K9、D9。同時研究結果表明，發酵飼料前提取溶劑選擇對抑菌結果有明顯影響，通過旋轉蒸發濃縮提取液的濃度也可使發酵飼料的抑菌結果更為明顯。

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