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長期飼喂不同蛋白質水平飼糧對豬脂肪代謝相關基因表達的影響

2018-12-19 10:35:37      點擊:
導讀

豬肉是人類最主要的食物蛋白質源,我國是生豬生產及消費大國,飼糧蛋白質水平是影響養豬業的最主要的經濟及環境因素之一。目前多數飼糧蛋白質水平遠遠超過動物生長發育需要量,不僅增加了生豬養殖業的成本,降低氮利用率,也增加養豬業的環境壓力。飼糧蛋白質在動物生長發育中起到重要的營養及生理功能,目前有研究指出添加滿足動物需求必需氨基酸的低蛋白質飼糧可達到相似的氮吸收利用率和體重(BW);也有研究指出,降低飼糧蛋白質水平可降低豬的生長性能,并增加豬肉脂肪含量,改善肉品質。Tian等指出飼糧蛋白質水平從20%降到17%顯著降低斷奶仔豬的生長性能,提高仔豬腸道消化吸收。Madeira等提出飼糧蛋白質水平從16%降為13%可增加肥育豬背部脂肪厚度以及豬肉肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)含量、多汁性等肉品質,但降低肥育豬生長性能;同時也指出添加精氨酸的低蛋白質水平飼糧不影響肥育豬肌肉IMF含量,而添加亮氨酸的低蛋白質水平飼糧可增加肌肉IMF含量。然而也有研究指出,添加精氨酸影響豬肉品質,如降低豬總脂肪的沉積,增加肌肉IMF含量,提高肌肉的抗氧化能力等。Tous等指出62~97kg豬飼糧蛋白質水平從12%降低到9.8%不影響豬的生長性能,但增加肌肉IMF含量;添加賴氨酸(Lys)可以提高豬肉品質,不影響豬的生長性能。

隨著人們生活水平的提高,豬肉品質備受消費者的關注,是消費者首要衡量指標。脂肪及脂肪酸是決定豬肉食用品質的重要因素,尤其是IMF的含量在肉品質方面起到重要作用。目前通過降低飼糧蛋白質和添加氨基酸等飼養策略來提高豬體內的脂肪分配。IMF含量是影響口感及風味等感官質量性狀的重要因素之一,同時IMF含量也影響肌肉的滴水損失及多汁性。近年來瘦肉型豬選育降低將近1%的IMF,這也是導致肉質變差的主要原因之一,因此人們對肉的IMF含量的關注也越來越高。關于促進IMF沉積的研究也越來越多,通過降低飼糧中蛋白質水平來改變IMF的含量是典型的方法。為此,本試驗通過降低豬各生長階段飼糧蛋白質水平,研究其對脂肪代謝相關基因表達的影響,為降低生豬養殖成本及氮排放量、提高豬肉品質提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗動物及設計

選取18頭三元(杜×長×大)雜交28日齡斷奶仔豬[BW=(9.57±0.64)kg],隨機分為3組,每組6個重復,每個重復1頭。飼養在豬籠里,每籠1頭。對照組[高粗蛋白質(high crude protein,HCP)組]采用符合NRC(2012)推薦營養需要的飼糧,試驗組是根據NRC(2012)標準,在添加Lys、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Try)4種必需氨基酸基礎上,將飼糧蛋白質水平分別降低3%[中粗蛋白質(medium crude protein,MCP)組]和6%[低粗蛋白質(low crude protein,LCP)組]。28日齡斷奶仔豬經過7d預試期后,進入正試期,正試期進行分階段持續飼喂,至肥育結束。在仔豬階段,LCP、MCP及HCP組分別飼喂粗蛋白質水平為14%、17%、20%的飼糧,共飼喂45d;在生長豬階段,LCP、MCP及HCP組分別飼喂粗蛋白質水平為12%、15%、18%的飼糧,共飼喂30d;在肥育豬階段,LCP、MCP及HCP組分別飼喂粗蛋白質水平為10%、13%、16%的飼糧,共飼喂50d(表1)。飼養試驗結束后進行動物屠宰、樣品采集。試驗飼糧組成及營養水平見表2。試驗期間采取自由采食及飲水方式進行飼養。

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1.2 屠宰及樣品采集

屠宰前肥育豬進行電擊處死,動物處死后,立即進行組織、臟器等分離并放于冰上。取80g背最長肌(LDM)放于封口袋中置于-80℃保存,以備于檢測IMF含量;分別取3gLDM并分裝到3個1.5mL的EP管中,立即放于液氮中,最終轉移到-80℃保存;取肝臟組織(每次切取保證部位一致性)大約3g,將肝臟組織用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,去除肝臟組織表面血液并用吸水紙吸去水分,分裝到3個1.5mL的EP管中,立即放于液氮中,最終轉移到-80℃保存。


1.3 IMF含量測定

將LDM去筋膜后攪碎,取40g肌肉樣品放入培養皿中攤平后放入-80℃冰箱冷凍過夜,樣品放入冷凍干燥器內凍干后稱重。用濾筒稱取凍干樣品3g,利用脂肪儀(FOSS-2055 SOXTEC)通過索氏萃取法檢測IMF含量。計算公式如下:IMF含量(%)=100×(油杯重-鋁杯重)/上樣量。


1.4 脂肪代相關基因表達量測定

與肉品質相關的脂肪代謝基因包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ( peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma,PPARγ) 、過氧化物酶體增殖物激活受體α ( peroxisome proliferator-activatedreceptor alfa,PPARα) 、脂肪酸合成酶( fatty acidsynthase,FAS) 、膽固醇調節元件結合蛋白( sterolregulatory element binding protein,SREBP) 、脂肪酸結合蛋白( fatty acid binding proteins,FABP) 、肉毒堿棕櫚酰轉移酶( carnitine palmitoyltransferase,CPT) 、硬脂酰輔酶A 去飽和酶( stearoyl CoA desaturase,SCD) 、甘油三酯脂酶( adipose triglyceridelipase,ATGL) 、乙酰輔酶A 羧化酶( acetyl CoA carboxylase,ACC ) 、蘋果酸酶1 ( malicenzyme 1,ME1) 、二烯酰輔酶A 還原酶( 2,4-dienoyl-CoA reductase,DECR) 、錨蛋白1( ankyrin 1,ANK1) 基因。用TRIzol 試劑盒( TaKaRa,日本) 提取100 mg 肝臟組織或LDM 樣品總RNA 并溶解在RNase-free水中。根據反轉錄試劑盒( TaKaRa,日本) 說明書將總RNA( 1 μg) 反轉錄為cDNA。根據GenBank中豬的基因序列,使用Primer premier 5.0 設計引物( 表2) 。制作實時定量PCR 標準曲線,確認最佳反應條件。反應體系( 20 μL ) : 2μL cDNA,10 μL SYBR Green 2×mix,上、下游引物各0.8 μL( 100 nmol /L ) ,6.4 μL 的ddH2O。反應條件:95 ℃預變性3 min; 95 ℃ 變性15 s,退火30 s,72 ℃延伸30 s,39 個循環。通過對β 肌動蛋白( β-actin) 以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶( GADPH) 管家基因進行篩選,選擇表達更穩定的β-actin 作為實時定量PCR 的內參基因。目的基因表達量計算采用2-ΔΔCt法。

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1.5 統計分析

試驗數據利用Prism 6 軟件的one-way ANOVA程序進行統計分析。數據均以平均值±標準誤( mean±SE) 表示,P<0.05 為差異顯著。

2結 果

2.1 飼糧蛋白質水平對LDM中IMF含量的影響

如圖1所示,在LDM中,HCP組中IMF的含量顯著高于LCP及MCP組(P<0.05),而LCP和MCP組中IMF的含量無顯著性差異(P>0.05)。

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2.2 飼糧蛋白質水平對豬肝臟組織脂肪代謝相關基因表達的影響

由表4可知,在肝臟中,SREBP、ACC、ME1、SCD及ANK1的基因表達量變化趨勢具有一致性,而FABP在肝臟中的表達趨勢則相反。與LCP組相比,MCP及HCP組中SREBP、ACC、FAS、ME1、SCD的基因表達量升高,其中FAS、ACC和ME1基因表達量顯著升高(P<0.05);ANK1在HCP組的基因表達量顯著高于LCP組(P<0.05),而其在MCP組與其他2組相比無顯著性差異(P>0.05)。在肝臟中,PPARγ及FABP的基因表達量變化趨勢相同,LCP組顯著高于MCP及HCP組(P<0.05),但MCP組與HCP組無顯著差異(P>0.05);PPARα及CPT在LCP及MCP組的基因表達量無顯著性差異(P>0.05),但均顯著低于HCP組(P<0.05);飼糧蛋白質水平對肝臟中SREBP、SCD、ATGL、DECR的基因表達量無顯著差異(P>0.05)。

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2.3 飼糧蛋白質水平對LDM脂肪代謝相關基因表達的影響

由表5可知,在LDM中,SREBP、ACC、FAS、SCD、FABP及PPARα的基因表達量變化趨勢具有相似性,MCP組高于LCP和HCP組,其中SREBP、FAS及SCD在MCP組的基因表達量顯著高于其他2組(P<0.05);ACC及FABP在LCP組的基因表達量顯著低于MCP及HCP組(P<0.05),但MCP組與HCP組差異不顯著(P>0.05);ME1在HCP組的基因表達量顯著高于LCP組(P<0.05),而MCP組與其他2組無顯著差異(P>0.05);ANK1在LCP和MCP組的基因表達量無顯著差異(P>0.05),但均顯著高于HCP組(P<0.05);PPARα及PPARγ在3組中的基因表達量無顯著差異(P>0.05);CPT在HCP組的基因表達量顯著高于其他2組(P<0.05),但MCP組與LCP組無顯著差異(P>0.05);飼糧蛋白質水平對LDM中ATGL和DECR的基因表達量無顯著影響(P>0.05)。

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討 論

3.1 飼糧蛋白質水平對豬生長性能的影響

在目前養豬業的背景下,基于生態環境及經濟壓力,降低飼糧蛋白質水平既能降低養豬業成本,同時也能減少氮排放。有研究表示,低蛋白質飼糧可以在降低氮排放及氨釋放的同時不影響豬的生長性能; 也有研究指出,降低飼糧蛋白質水平將影響豬的生長性能。另有研究結果顯示,在滿足必需氨基酸Lys、Met、Thr、Try 需要量的基礎上,降低飼糧蛋白質水平影響仔豬及生長豬生長性能,但并不改變肥育豬生長性能。本課題組的另一項研究表明,仔豬斷奶后隨著飼糧蛋白質水平的降低,仔豬生長性能也出現不同程度的降低,而持續飼喂低蛋白質水平飼糧至生長豬階段,飼糧蛋白質水平對生長豬生長性能與其對仔豬生長性能的影響具有一致性,但持續降低飼糧蛋白質水平并不影響肥育豬平均日增重、平均日采食量及料重比。本課題組研究表明,在斷奶初期降低飼糧蛋白質水平不利于仔豬克服斷奶應激,影響斷奶仔豬生長性能。低蛋白質水平飼糧對仔豬生長性能的影響可能是由于仔豬處在斷奶這一特殊時期引起的,仔豬斷奶后發生應激反應,包括營養性應激、環境應激及心理應激。斷奶后,能量來源的轉變,腸道損傷及腸道微生物的改變,母源抗體的消失引起仔豬免疫力低下,影響仔豬生理生長狀況。低蛋白質水平飼糧即使平衡了Lys、Met、Thr、Try,但可能由于其他必需氨基酸的不足,不能滿足仔豬營養需求,從而導致其生長性能的降低。而隨著飼喂時間延長,仔豬度過斷奶應激時期后,生長豬生長性能依然隨著飼糧蛋白質水平的降低而呈現顯著下降,可能是由于低蛋白質飼糧降低仔豬的采食量,仔豬采食量的降低不利于其腸道等的消化道損傷的修復、斷奶后變化的適應及斷奶應激的忍受,從而影響后續生長豬的消化吸收功能; 此外,采食量是決定日增重的重要因素之一,Brillouet證明仔豬日增重的降低會影響后期生長。但持續飼喂到肥育豬階段,與對照組相比,低蛋白質水平飼糧對豬生長性能仍有持續性消極影響,但中蛋白質水平飼糧對肥育豬生長性能無顯著影響,說明過低的蛋白質飼糧不利于豬的生長,而中蛋白質水平飼糧在后期肥育豬階段并不影響豬的生長,進一步證明持續地飼喂低蛋白質飼糧不利于豬的前期生長。


3.2 飼糧蛋白質水平對肝臟脂肪代謝相關基因表達的影響

肌肉脂肪含量及組成影響豬肉品質,動物體內脂肪的獲得有2 條途徑,一是通過食物中攝取脂肪經小腸分解成甘油和脂肪酸消化吸收后,由肝臟合成脂肪酸后運輸到身體各部位; 另外肝臟中脂肪代謝酶催化糖及氨基酸代謝中間產物的內源性合成。肝臟內含有種類豐富的脂肪代謝相關酶,是動物體內脂肪酸合成的重要場所,在脂肪代謝中起重要作用,因此肝臟中脂肪代謝影響肌肉內脂肪代謝,進而影響肉品質。

過氧化物酶體增殖物激活受體( PPAR) 及SERBP 是調節脂質代謝的重要轉錄因子。PPARα 和PPARγ 屬于PPAR 超家族成員,通過線粒體及過氧化物酶體的β-氧化作用調控游離脂肪酸( free fatty acid,FFA) 的氧化、吸收,參與調控脂肪代謝; SREBP 作為脂類合成的候選基因調控FAS、ME1、ACC 等基因表達。本試驗結果表明,低蛋白質水平飼糧降低肝臟中SREBP、FAS、ME1 及ACC 的基因表達量,其中FAS、ME1及ACC 的基因表達量顯著低于其他2 組,而其他2 組間無顯著差異。SREBP、FAS、ME1 及ACC 參與調控FFA 的從頭合成,因此低蛋白質水平飼糧通過降低FFA 的從頭合成,影響肝臟FFA 的合成代謝,而中蛋白質飼糧與高蛋白質飼糧無顯著差異,說明適當降低飼糧蛋白質水平不影響肝臟脂肪酸合成相關基因的表達量。

PPARγ 調控脂肪細胞分化、轉運及脂肪沉積相關蛋白基因表達來調節脂肪代謝,而FABP 通過細胞膜結構促進脂肪酸和其他脂類介質的轉運,也可促進脂肪酸及親脂類分子通過細胞質到核受體的細胞外轉運。本試驗結果顯示,PPARγ 及FABP 等參與脂肪酸轉運基因的表達量變化與SREBP、FAS、ME1、ACC 等脂肪酸合成基因相反,LCP 組PPARγ 及FABP 的基因表達量顯著高于其他2 組,說明過度的降低飼糧蛋白質水平通過上調轉錄因子PPARγ 的基因表達量、增加FABP 的基因表達量,從而促進肝臟脂肪酸的轉運。以上結果說明,低蛋白質水平飼糧可降低肝臟脂肪酸合成,增加脂肪酸的轉運; 但飼喂中蛋白質水平飼糧與高蛋白質水平飼糧的豬肝臟中脂肪酸合成及轉運基因表達量無顯著差異,表明適當降低飼糧蛋白質水平并不影響豬肝臟中脂肪酸合成及轉運過程。

PPARα 通過調控脂類代謝基因的表達來調節線粒體及過氧化物酶體脂肪酸氧化、生酮及糖異生,影響脂肪代謝率,肝臟中PPARα 及CPT在HCP 組的基因表達量顯著高于LCP 及MCP組,說明降低蛋白質水平飼糧不利于肝臟中脂肪酸的氧化分解及代謝。

因此,適當降低飼糧蛋白質水平不影響肝臟中脂肪酸合成及轉運相關基因的表達,同時降低了肝臟內脂肪酸的氧化分解,說明適當降低飼糧蛋白質水平促進了肝臟脂肪酸合成代謝并降低其分解代謝,因此增加脂肪酸從肝臟向身體各組織的運輸。


3.3 飼糧蛋白質水平對LDM 脂肪代謝的影響

IMF影響肉的口感、肉色、風味等感官質量性狀。肌肉IMF 的含量與肌肉脂肪代謝密切相關,IMF 含量取決于脂肪酸合成、分解、轉運及沉積等。因此研究肌肉脂肪代謝為改善豬肉品質奠定了理論依據。本試驗結果顯示,MCP 組LDMSREBP、ACC、FAS、SCD、FABP 的基因表達量最高,其中SREBP、FAS、SCD 的基因表達量顯著高于LCP 及HCP 組,ACC 及FABP 的基因表達量顯著高于LCP 組而與HCP 組無顯著差異,以上結果表明適當降低飼糧蛋白質水平促進LDM 中脂肪酸合成及轉運。LDM 中ME1 在HCP 組的基因表達量顯著高于LCP 組,而其在MCP 組表達量與LCP 及HCP 組無顯著差異,說明低蛋白質水平飼糧不僅降低肝臟中脂肪酸的從頭合成,同時也降低LDM 中脂肪酸的從頭合成,而中蛋白質飼糧對LDM 中脂肪酸的從頭合成無顯著影響。有研究指出,生長豬及肥育豬階段降低飼糧蛋白質水平可促進ACC、FAS、ME1 等脂肪酸合成相關基因的表達,說明長期過度降低飼糧蛋白質水平不利于肌肉中脂肪酸合成。Doran 等指出低蛋白質水平飼糧誘導肌肉中SCD 基因的表達,從而促進肌肉中IMF 的沉積。而本試驗結果顯示,適當的降低飼糧蛋白質水平雖然誘導LDM 中SCD 等脂肪酸合成基因的表達,同時也降低IMF 的含量。

Teye 等指出低蛋白質飼糧可增加LDM 的嫩度、多汁性及IMF 等肉品質,同時低蛋白質飼糧增加脂肪酸的氧化分解。而本試驗獲得相反的結果,降低飼糧蛋白質水平不影響豬肝臟及肌肉組織中脂肪酸氧化分解相關基因ATGL、DECR 的表達,但降低LDM 中CPT 的基因表達量,說明低蛋白質飼糧是通過降低了長鏈脂肪酸的氧化分解,而不是影響肝臟及肌肉組織中甘油三酯水解及不飽和脂肪酸氧化分解來降低肌肉內脂肪酸的氧化分解。而肌肉中PPARα 基因表達量在3 個蛋白質水平飼糧組中并沒有表現出顯著性差異,PPARγ 與FABP 的表達趨勢不一致,說明PPAR在調控脂肪酸氧化分解、轉運具有組織特異性,存在其他的通路與PPAR 共同調控肌肉中脂肪酸的代謝。

Zhao 等指出IMF 的含量取決于脂肪酸合成、轉運及分解速度。本試驗結果顯示,MCP 組LDM 中脂肪酸合成相關基因SREBP、ACC、FAS、SCD 基因表達量高于其他2 組,脂肪酸轉運蛋白FABP 的基因表達量也高于HCP 組,同時脂肪酸氧化分解基因ATGL、DECR 基因表達量沒有顯著變化,脂肪酸氧化分解相關基因CPT 的基因表達量也顯著低于HCP 組,但是IMF 的含量卻顯著低于HCP 組。降低飼糧蛋白質水平可降低肝臟中ANK1 的基因表達量,而肌肉中ANK1 的基因表達量變化則相反。錨蛋白( ANK) 是重要的結構蛋白質家族基因,其中ANK1 是與肉品質相關的功能性候選基因,尤其是IMF 及系水力的影響。降低飼糧蛋白質水平可增加肌肉中ANK1 的基因表達量,可能是通過增加肌肉內細胞骨架蛋白質水解及重排降低IMF 重要組成脂肪小球的聚集,從而降低了LDM 的IMF 含量,這也說明ANK1 可能是決定IMF 沉積的決定因素。上述研究結果提示,IMF 的沉積可能不僅由脂肪酸合成、轉運以及分解決定。研究指出,脂肪的沉積可能與三大營養物質蛋白質、糖類、脂類代謝過程緊密相關。Hamill 等提出在IMF 含量高的肌肉組織中,許多脂肪酸氧化分解途徑相關基因表達下調,高IMF 含量抑制肌肉中脂肪酸周轉,從而影響肌肉中脂肪的沉積。

        飼糧蛋白質水平降低影響仔豬及生長豬生長性能,即使在長期飼喂MCP 飼糧并沒有影響肥育豬的生長性能,但降低肥育豬的LDM 中IMF 含量。豬生長初期,尤其是斷奶仔豬不適合降低飼糧蛋白質水平,斷奶初期的飼喂低蛋白質水平飼糧也可能導致后期肥育豬肉品質下降。Gondret等也提出長期降低飼糧蛋白質水平可導致IMF 含量的降低,同時也指出IMF 的聚集取決于脂肪細胞中脂肪酸合成與肌纖維細胞中脂肪酸氧化分解的平衡,也就是脂肪酸的周轉。因此,長期持續適當降低飼糧蛋白質水平能夠提高LDM 中脂肪酸的合成、轉運,并降低其分解,但沒有提高LDM 的IMF 含量,說明提高IMF 不只是與脂肪代謝相關,同時與其他營養物質代謝緊密相關。即使中蛋白質水平飼糧增加脂肪酸合成,由于從仔豬到生長肥育豬全程階段降低蛋白質水平可能影響蛋白質、脂肪酸合成代謝,不能滿足機體對蛋白質、脂肪酸的需求,導致脂肪酸及糖類物質向氨基酸的轉換,從而影響了肌肉中脂肪的沉積。在肥育豬階段合理降低飼糧蛋白質水平,不影響其生長性能前提下,可通過調節飼糧營養成分及比例,如添加某種氨基酸等方法增加IMF 含量,提高肉品質。因此要通過降低飼糧蛋白質水平調節豬肉品質,除了調節飼糧中粗蛋白質水平還要考慮到降低蛋白質水平的幅度、添加氨基酸的種類、時間點的選擇及期限,從而達到既能降低氮排放、飼養成本,又能提高豬肉品質的效果。

4結 論

① 適當降低飼糧蛋白質水平( 6%) 對肝臟中脂肪酸合成相關基因的表達無顯著影響。

② 從仔豬到肥育豬階段全程降低飼糧蛋白質水平可促進LDM 中脂肪酸合成、轉運相關基因的表達,但顯著降低豬LDM 中IMF 的沉積,不利于肉品質的改善。

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