2.1 基料制備實驗結(jié)果與分析

2.1.1 單因素實驗

在基料制備過程中，為使啤酒酵母和乳酸菌始終保持最佳生長狀態(tài)，固定發(fā)酵時間為5d，通過Plactett-Burman實驗選取顯著影響基料總菌落數(shù)的4個因素(仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度、含水量)設(shè)計單因素實驗。

2.1.1.1 仁渣目數(shù)的影響

在菌料比(質(zhì)量比，下同)1∶80，發(fā)酵溫度28℃，含水量30%，棕櫚仁渣目數(shù)分別為10、20、40、60、80目條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析仁渣目數(shù)對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖1。注:圖中相同字母表示總菌落數(shù)之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，下同。圖1仁渣目數(shù)對總菌落數(shù)的影響由圖1可知，當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)在10～60目時，基料中總菌落數(shù)隨著棕櫚仁渣目數(shù)增大而顯著增多(P＜0.05)，當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)在60～80目時，基料中總菌落數(shù)隨著棕櫚仁渣目數(shù)增大而顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于當(dāng)棕櫚仁渣目數(shù)為60目時，啤酒酵母和乳酸菌與棕櫚仁渣有效接觸面積趨于最大，隨后棕櫚仁渣因自重影響發(fā)生粘黏，有效接觸面積減少，啤酒酵母和乳酸菌無法充分利用棕櫚仁渣營養(yǎng)物質(zhì)生長發(fā)酵。故棕櫚仁渣目數(shù)選擇60目為宜。

2.1.1.2 菌料比的影響

在仁渣目數(shù)60目，發(fā)酵溫度28℃，含水量30%，菌料比分別為1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析菌料比對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)菌料比在1∶80～1∶100時，基料中總菌落數(shù)隨著菌料比的增大呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)增大菌料比，總菌落數(shù)顯著降低(P＜0.05)，這可能是棕櫚仁渣營養(yǎng)物質(zhì)已被啤酒酵母和乳酸菌分解利用完畢，微生物細胞停止生長甚至開始死亡所造成的結(jié)果。因此，菌料比選擇1∶100為宜。

2.1.1.3 發(fā)酵溫度的影響

在仁渣目數(shù)60目，菌料比1∶100，含水量30%，發(fā)酵溫度分別為24、26、28、30、32℃條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析發(fā)酵溫度對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在24～30℃時，基料中總菌落數(shù)隨著發(fā)酵溫度的上升呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，總菌落數(shù)略有降低(P＞0.05)，這是因為隨著溫度的升高酶反應(yīng)速度加快，啤酒酵母和乳酸菌細胞生長代謝加快，當(dāng)溫度高于30℃時酶失活速率大于微生物細胞生長代謝速率，導(dǎo)致微生物細胞衰老加快。故發(fā)酵溫度選擇30℃為宜。

2.1.1.4 含水量的影響

在仁渣目數(shù)60目，菌料比1∶100，發(fā)酵溫度30℃，含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%條件下，測定基料中總菌落數(shù)，分析含水量對啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵棕櫚仁渣的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)含水量由30%增至35%時，基料中的總菌落數(shù)隨著含水量的增大而顯著增加(P＜0.05)，隨著含水量的繼續(xù)增加，總菌落數(shù)呈逐漸降低趨勢(P＜0.05)，這可能是由于適宜的含水量使得棕櫚仁渣的細小顆粒之間存在一定的空隙和合適的疏松度，有利于微生物進入，在增大微生物與棕櫚仁渣表面接觸面積的同時排出微生物菌體代謝所產(chǎn)生的CO2，促進微生物菌體生長。故含水量選擇35%為宜。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.1.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計原理，以仁渣目數(shù)(A)、菌料比(B)、發(fā)酵溫度(C)和含水量(D)為響應(yīng)變量，基料中總菌落數(shù)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，響應(yīng)面優(yōu)化實驗共設(shè)計29個實驗點。Box-Behnken實驗因素水平見表2，Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

利用Design Expert10.0.4軟件對表3實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到總菌落數(shù)對仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度和含水量的二次多項式回歸方程:總菌落數(shù)=7.35+0.22A+1.22B+0.41C+0.28D+0.011AB-0.002AC-0.12AD+0.015BC-0.18BD-0.017CD-0.13A2-3.86B2-1.29C2-0.72D2。

該模型的分析結(jié)果及模型系數(shù)顯著性檢驗見表4。

由表4可知，二次回歸模型F值為154.690，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項P=0.3088＞0.05，失擬項差異不顯著，說明實驗數(shù)據(jù)均可用此回歸模型描述，未知因素對實驗結(jié)果影響很小。模型決定系數(shù)R2=0.9936，說明99.36%的實驗數(shù)據(jù)變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實際情況擬合，較好地反映了基料中總菌落數(shù)與仁渣目數(shù)、菌料比、發(fā)酵溫度和含水量之間的關(guān)系，因此該回歸方程可較好預(yù)測總菌落數(shù)隨各參數(shù)的變化規(guī)律。校正系數(shù)R2Adj=0.9872，說明實驗結(jié)果有98.72%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于總菌落數(shù)分析和預(yù)測。通過表4中F值可判斷各自變量對因變量的影響依次為B＞C＞D＞A，即菌料比對總菌落數(shù)的影響最大(P＜0.01)，其次為發(fā)酵溫度(P＜0.01)、含水量(P＜0.01)和仁渣目數(shù)(P＜0.01)。由回歸方程和方差分析可知，二次項中B2、C2、D2對總菌落數(shù)的影響達極顯著水平(P＜0.01)。

2.1.2.2 工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken實驗結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測基料制備的最佳工藝條件為棕櫚仁渣目數(shù)75.92目、菌料比1∶103.14、發(fā)酵溫度30.81℃、含水量35.53%，此條件下總菌落數(shù)為7.58×1010個/g。

2.1.2.3 模型驗證

為了驗證響應(yīng)面模型的可預(yù)見性，同時為了簡化實驗操作，將基料制備工藝的最佳發(fā)酵條件修正為棕櫚仁渣目數(shù)70目、菌料比1∶103、發(fā)酵溫度30℃、含水量36%，該條件下進行3次平行實驗，總菌落數(shù)達到7.2×1010個/g，RSD為4.42%，與模型預(yù)測值誤差為5.01%。經(jīng)SPSS下ANOVA分析，驗證實驗總菌落數(shù)與預(yù)測總菌落數(shù)差異不顯著(P=0.056＞0.05)。說明該模型可以有效預(yù)測基料制備過程中的總菌落數(shù)，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用來指導(dǎo)啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚粕渣的發(fā)酵工藝。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物實驗結(jié)果與分析

2.2.1 單因素實驗

在產(chǎn)物發(fā)酵過程中，為使發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)成分歸一值達到最好，固定發(fā)酵溫度為30℃，棕櫚果渣與空果串配比為1∶2。通過Plactett-Burman實驗選取顯著影響發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值的4個因素(棕櫚果渣及空果串的粉碎長度(以下簡稱粉碎長度)、基料與棕櫚果渣和空果串配料比(以下簡稱配料比)、含水量、發(fā)酵時間)設(shè)計單因素實驗。

2.2.1.1 粉碎長度的影響

在配料比1∶8(質(zhì)量比，下同)，含水量30%，發(fā)酵時間30d，粉碎長度分別為1、3、5、7、9cm條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析粉碎長度對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖5。

 

由圖5可知，當(dāng)粉碎長度在1～5cm時，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨粉碎長度的增長而呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)增長粉碎長度，營養(yǎng)成分OD值開始顯著降低(P＜0.05)，這說明棕櫚果渣和空果串粉碎長度過長，會致使其與基料混合不均勻，從而影響啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚果渣和空果串的發(fā)酵。故粉碎長度選擇5cm為宜。

2.2.1.2 配料比的影響

在粉碎長度5cm，含水量30%，發(fā)酵時間30d，配料比分別為1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析配料比對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當(dāng)配料比在1∶8～1∶10時，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨配料比的增大而呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)增大配料比，營養(yǎng)成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這說明配料比過小，會致使菌落數(shù)劇增過快，從而產(chǎn)生過多的代謝廢物，導(dǎo)致菌種容易衰老，不利于發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的提高，配料比過大，總菌落增長緩慢，培養(yǎng)時間長，使發(fā)酵周期延長，導(dǎo)致發(fā)酵成本的提升，同時會降低菌種活力，從而使菌種降解底物能力下降，營養(yǎng)成分含量降低。配料比為1∶10時，既能保證合理縮短發(fā)酵周期，又能得到較高的營養(yǎng)成分含量。故配料比選擇1∶10為宜。

2.2.1.3 含水量的影響

在粉碎長度5cm，配料比1∶10，發(fā)酵時間30d，含水量分別為25%、30%、35%、40%、45%條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析含水量對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，當(dāng)含水量在25%～35%時，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨含水量的增大呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續(xù)加大含水量，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于含水量過低，導(dǎo)致固態(tài)介質(zhì)中營養(yǎng)成分溶解度的下降及較低的基質(zhì)膨潤度，微生物生長受抑制，營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)換率降低，而含水量過高，導(dǎo)致基質(zhì)顆粒間孔隙率的降低、黏性增加，增加了微生物菌體代謝所產(chǎn)生的CO2的傳質(zhì)阻力，抑制微生物生長發(fā)酵。故含水量選擇35%為宜。

2.2.1.4 發(fā)酵時間的影響

在粉碎長度5cm，配料比1∶10，含水量35%，發(fā)酵時間分別為25、30、35、40、45d條件下，測定發(fā)酵產(chǎn)物OD值，分析發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵時間在25～35d時，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨發(fā)酵時間的延長而顯著上升(P＜0.05)，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值呈平緩上升趨勢(P＞0.05)，這是由于發(fā)酵過程中，產(chǎn)物營養(yǎng)成分濃度始終在變化，一般高峰生長階段時間越長，其生產(chǎn)率越高，但到一定時間后生產(chǎn)率提高緩慢。為了獲得更多的產(chǎn)物營養(yǎng)成分，時間過短，不足以獲得所需的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)品;時間過長，由于環(huán)境已不利于菌體生長，往往會造成菌體消溶，同時增加生產(chǎn)成本。因此，發(fā)酵時間選擇35d為宜。

2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.2.1響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計原理，以粉碎長度(X1)、配料比(X2)、含水量(X3)和發(fā)酵時間(X4)為響應(yīng)變量，發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，響應(yīng)面優(yōu)化實驗共設(shè)計29個實驗點。Box-Behnken實驗因素水平見表5，Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

利用DesignExpert10.0.4軟件對表6實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到粉碎長度、配料比、含水量和發(fā)酵時間的二次多項式回歸方程:OD值=0.95-0.025X1+0.17X2+0.026X3+0.049X4+0.001X1X2+0.026X1X3+0.024X1X4-0.021X2X3+0.002X2X4-0.005X3X4-0.019X21-0.53X22-0.088X23-0.18X24。

該模型的分析結(jié)果及模型系數(shù)顯著性檢驗見表7。

由表7可知，二次回歸模型F值為162.210，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項P=0.2341＞0.05，失擬項差異不顯著，說明實驗數(shù)據(jù)均可用此回歸模型描述，未知因素對實驗結(jié)果影響很小。模型決定系數(shù)R2=0.9939，說明99.39%的實驗數(shù)據(jù)變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實際情況擬合，較好地反映了發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值與粉碎長度、配料比、含水量、發(fā)132CHINAOILSANDFATS2020Vol.45No.3酵時間之間的關(guān)系，因此該回歸方程可較好預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值隨各參數(shù)的變化規(guī)律。校正系數(shù)R2Adj=0.9877，說明實驗結(jié)果有98.77%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值分析和預(yù)測。通過表7中F值可判斷各自變量對因變量的影響依次為X2＞X4＞X3＞X1，即配料比對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值的影響最大(P＜0.01)，其次為發(fā)酵時間(P＜0.01)、含水量(P＜0.05)和粉碎長度(P＜0.05)。由回歸方程和方差分析可知，二次項中X22、X23、X24對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分OD值的影響達極顯著水平(P＜0.01)。

2.2.2.2 工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken實驗所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物制備的最佳工藝條件為粉碎長度3.94cm、配料比1∶10.16、含水量35.23%、發(fā)酵時間35.50d，此條件下OD值為0.976。

2.2.2.3 模型驗證

為了驗證響應(yīng)面模型的可預(yù)見性，同時為了簡化實驗操作，將發(fā)酵產(chǎn)物制備工藝的最佳發(fā)酵條件修正為粉碎長度4cm、配料比1∶10、含水量35%、發(fā)酵時間36d，該條件下進行3次平行實驗，OD值為0.966，RSD為1.66%，與模型預(yù)測值誤差為1.02%。經(jīng)SPSS下ANOVA分析，驗證實驗OD值與預(yù)測OD值差異不顯著(P=0.376＞0.05)。說明該模型可以有效預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分，優(yōu)化結(jié)果可靠，可用于指導(dǎo)啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚粕渣飼料的發(fā)酵工藝。

2.3 成分分析

優(yōu)化條件下對基料和發(fā)酵產(chǎn)物進行主要成分分析，結(jié)果見表8。

 

由表8可知:棕櫚仁渣經(jīng)啤酒酵母和乳酸菌發(fā)酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，總菌落數(shù)為7.2×1010個/g;發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，總菌落數(shù)為9.0×107個/g。

通過發(fā)酵產(chǎn)物替代部分傳統(tǒng)粗飼料中玉米秸稈后進行肉牛喂養(yǎng)實驗，肉牛健康狀況良好，飼料消化吸收利用率高，育肥效果顯著。因此，該研究可為啤酒酵母和乳酸菌應(yīng)用于棕櫚粕渣發(fā)酵飼料工業(yè)及棕櫚粕渣資源高值化利用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

3結(jié)論