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兩階段調(diào)控優(yōu)化保加利亞乳桿菌合成γ-氨基丁酸

2021-06-30 16:13:30      點擊:

摘要:保加利亞乳桿菌ATCC 11842是制備富含γ-氨基丁酸(GABA)發(fā)酵飼料的優(yōu)良益生菌。菌株生長的最佳初始pH為6.0,最佳溫度為35℃。GABA生物合成的最佳pH為8.0,最佳溫度為40℃。兩階段發(fā)酵調(diào)控保加利亞乳桿菌ATCC 11842 生產(chǎn)GABA,GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98g/L,優(yōu)化后GABA產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了153.39%。

研究表明,兩階段分開控制菌株生長和GABA合成的pH和溫度,能顯著提高 GABA的產(chǎn)量。該方法為用保加利亞乳桿菌ATCC 11842生產(chǎn)富含γ-氨基丁酸的發(fā)酵飼料提供了科學(xué)依據(jù)。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸,具有降血壓、改善腦機能、增強記憶、抗焦慮等生理功能(Kantachote等,)。GABA作為飼料添加劑,能夠提高動物抗應(yīng)激能力,改善胴體品質(zhì)和提高生產(chǎn)性能(汪祥燕等)。潘雪梅等研究發(fā)現(xiàn),GABA可以緩解奶牛夏季的熱應(yīng)激,提高奶牛免疫能力和機體的抗氧化能力。Park等研究結(jié)果表明,GABA作為飼料添加劑能顯著提高蛋雞的生產(chǎn)能力,改善雞蛋品質(zhì)。常見的生產(chǎn)GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌(Kang等)。管軍軍等認(rèn)為,乳酸菌是定植在動物腸道中的益生菌,有利于動物的腸道健康,常被用于制備發(fā)酵飼料,有助于動物的健康養(yǎng)殖。徐秀景等研究表明,乳酸菌發(fā)酵制備的固態(tài)發(fā)酵飼料,能夠改善豬肉的品質(zhì),提高育肥豬的生長性能。乳酸菌與GABA的聯(lián)合生產(chǎn),能夠顯著改善飼料的營養(yǎng)品質(zhì)。沈雪嬌等研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)GABA的短乳桿菌P-14發(fā)酵飼料應(yīng)用于育肥豬的飼養(yǎng),能提高其生產(chǎn)性能,改善豬肉的品質(zhì),提高飼料的報酬率。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842是一種在食品加工領(lǐng)域重要的益生菌,在乳制品和功能飲料加工過程中已展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景(毛雪等)。在飼料加工領(lǐng)域,保加利亞乳桿菌ATCC 11842也具有良好的應(yīng)用前景。本研究通過探索保加利亞乳桿菌ATCC 11842生物合成GABA的規(guī)律,為生產(chǎn)富含GABA的發(fā)酵飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

GABA標(biāo)準(zhǔn)品、MRS培養(yǎng)基和谷氨酸鈉均購于北京某科技有限公司;

苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸鈉、氫氧化鈉和無水乙醇均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

保加利亞乳桿菌ATCC 11842保藏于江漢大學(xué)湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術(shù)研究中心食品加工實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1600 紫外可見分光光度計:上海美譜達(dá)儀器有限公司;

TG165 型離心機:長沙平凡儀器儀表有限公司;

HH-2 型水浴鍋:國華電器有限公司;

SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)與 GABA 生物合成方法

菌體培養(yǎng)方法:保加利亞乳桿菌ATCC 11842活化培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為30℃;保加利亞乳桿菌ATCC 11842生長培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基,接種量為2%;生長液體培養(yǎng)基置于50mL離心管,裝液量為48mL,調(diào)整液體培養(yǎng)基pH,控制培養(yǎng)溫度,厭氧靜置培養(yǎng),培養(yǎng)36h;每個樣品重復(fù)3次。

GABA生物合成方法:在菌體生長液體培養(yǎng)基中添加0.25g谷氨酸鈉底物,調(diào)整液體培養(yǎng)基pH,控制培養(yǎng)溫度,生物轉(zhuǎn)化48h;每個樣品重復(fù)3次。

1.3.2 菌體生物量測定方法

定時取0.5mL發(fā)酵培養(yǎng)基,6000r/min離心15min,棄上清液,用0.5mL無菌水懸浮菌體,在600nm條件下測定菌體光密度值(吳軍林等)。在600nm波長條件下,繪制菌體生物量與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計算出培養(yǎng)基中濕菌體的濃度。

1.3.3 GABA 樣品制備及其檢測方法

GABA樣品制備:取1mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基于1.5mL離心管,6000r/min離心10min,得到的上清液用于GABA含量的檢測。

檢測方法:取0.3mL上清液于25mL離心管中;依次加入0.2mL的0.2M硼酸鹽緩沖液(pH9.0),1mL的6%苯酚溶液,0.8mL的5%次氯酸鈉溶液,充分振蕩混勻;置于沸水浴中保持10min;然后迅速置于冰浴中保持15min;劇烈振蕩至顯示藍(lán)色;最后加入2mL的60%乙醇溶液;在645nm波長條件下檢測光密度值(Zhang等)。

2.結(jié)果與分析

乳酸菌生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生物合成GABA分為兩個階段。第一階段為乳酸菌的生長階段,在此階段需要提供乳酸菌良好生長環(huán)境,使乳酸菌達(dá)到最大的生物量;第二階段是GABA的生物合成階段,在此階段需要控制谷氨酸脫羧酶良好的活性環(huán)境,谷氨酸鈉在谷氨酸脫羧酶的催化作用下生物合成GABA(Ttt等)。Shi等研究表明用短乳桿菌靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA有兩個關(guān)鍵的控制因素,一是pH控制在4.5,二是溫度控制在45℃。Peng等研究結(jié)果也表明分步控制溫度和pH條件,用短乳桿菌CGMCC 1306生物轉(zhuǎn)化谷氨酸能獲得良好的轉(zhuǎn)化效率。因此,本研究探索分兩階段分別控制菌株的生長和GABA的生物合成,以期提高GABA的產(chǎn)量。

2.1 pH 和溫度對菌株生長的影響

由圖1可知,pH能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36h時,pH為5、6、7、8、9時的菌體生物量分別為11.60、17.10、15.58、13.93、9.48g/L。pH高于9時,菌株的生長受到顯著抑制。pH為6時菌株的生長最佳。終產(chǎn)物乳酸的積累是抑制乳酸菌生長的重要原因,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH會影響乳酸菌生長。閆征等研究表明,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH,乳酸菌在pH6和pH6.5條件下,表現(xiàn)出較好的生長。楊靜等的研究結(jié)果也表明,乳酸菌生長的最適pH為5.5~7.0。

由圖2可知,溫度能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36h時,溫度為25、30、35、40、45℃時的菌體生物量分別為13.60、15.44、16.90、15.62、5.40g/L。溫度高于45℃,菌株生長受到明顯抑制。其中35℃是菌株生長的最佳溫度。王奎明研究結(jié)果表明,保加利亞乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中和37℃條件下生長良好。培養(yǎng)基組分也會影響保加利亞乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度。曾少葵等以牡蠣酶解液為原料,保加利亞乳桿菌的最適生長溫度為40℃。

2.2 pH 和溫度對 GABA 生物合成的影響

pH和溫度會影響酶分子的活性結(jié)構(gòu)以及酶分子與底物的結(jié)合(周文斯;陳穩(wěn)等)。調(diào)控反應(yīng)的溫度和pH對谷氨酸脫羧酶活性有重要影響,進(jìn)而影響GABA的生物合成(Wu等;時粲等)。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS液體培養(yǎng)基中生長36h時,培養(yǎng)基pH降為6.0,當(dāng)添加0.25g谷氨酸鈉后,培養(yǎng)基pH變?yōu)?.5。在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵液的pH分別至5、6、7、8、9,溫度為35℃,生物轉(zhuǎn)化48h后,比較GABA的產(chǎn)量。由圖3可知,pH能顯著影響GABA的產(chǎn)量。在pH為5、6、7、8、9五個不同條件下GABA產(chǎn)量分別為3.25、3.30、3.75、5.0、3.71g/L。其中pH為8時GABA生物合成量最高。隨著菌株的生長,菌株產(chǎn)酸也會使發(fā)酵液的pH降低。孟丹等研究表明,乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH為6.5,其發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為0.22g/L。曾林等從四川泡菜中分離出一株具有產(chǎn)GABA能力的植物乳桿菌BC114,并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,其最佳pH為5.50,GABA產(chǎn)量為3.82g/L。

由圖4可知,溫度能顯著影響GABA的產(chǎn)量。在溫度為25、30、35、40、45℃條件下的GABA產(chǎn)量分別為2.57、2.69、3.33、4.77、3.96g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳溫度。韓昱姝等從泡菜中篩選出一株短乳桿菌LF-fb-017,其GABA產(chǎn)量可達(dá)1.68g/L,其最佳生物轉(zhuǎn)化溫度為37℃。Park等研究結(jié)果也表明,乳酸菌來源的谷氨酸脫羧酶最佳活性溫度為41℃。

2.3 優(yōu)化前后 GABA 產(chǎn)量的比較

參照前期研究方法,保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉合成GABA,在自然pH和恒溫30℃條件下,GABA產(chǎn)量為2.36g/L(Wang等)。用兩階段調(diào)控生物合成GABA的方法,菌株在初始pH6.0,溫度35℃條件下生長36h,再調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0,溫度調(diào)整至40℃,生物轉(zhuǎn)化48h,GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98g/L,如圖5。優(yōu)化后GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前GABA的產(chǎn)量提高了153.39%。張竺英等(2014)從豆豉中篩選的產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15,該菌株在含1%(W/W)谷氨酸鈉的MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)48h后,發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量達(dá)到0.161g/L。史曉萌等從哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出一株乳酸乳球菌KCH1,GABA產(chǎn)量達(dá)329.81mg/L。吳非等利用紫外線對GABA高產(chǎn)菌株保加利亞乳桿菌L2進(jìn)行誘變處理,獲得高產(chǎn)GABA突變菌株L2-4,其在含有1%L—谷氨酸改良MRS培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量達(dá)到4.235g/L。因此,保加利亞乳桿菌ATCC 11842 GABA的合成能力顯著高于上述報道的乳酸菌株。

3.結(jié)論

本試驗結(jié)果表明,對菌株生長和GABA生物合成的pH和溫度進(jìn)行兩階段分開控制,能顯著提高GABA的產(chǎn)量。菌株在初始pH 6.0,溫度35℃條件下生長36h后,再調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0,溫度40℃,GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98g/L。優(yōu)化后GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前GABA的產(chǎn)量提高153.39%。


多功能生物發(fā)酵活菌肽——無抗養(yǎng)殖推薦產(chǎn)品,益生菌發(fā)酵中草藥組合的動物腸道保健的佼佼者,提高動物健康水平減少死亡淘汰率,降低料耗增重加快提前出欄,快速降低養(yǎng)殖欄舍臭味

多功能生物發(fā)酵活菌肽-產(chǎn)品說明書

打開本產(chǎn)品包裝袋,香氣四溢(養(yǎng)殖場拌料飼喂運用后,整個養(yǎng)殖欄舍中都香氣撲鼻,讓人非常震撼,這種宜人的香醇味是一般產(chǎn)品所無法比擬的),得益于高端的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)與大量能量和蛋白飼料的運用,本品1公斤相當(dāng)于約1.5~2公斤全價飼料能量,有效活菌數(shù)高達(dá)約200億/克,結(jié)合中草藥輔助形成對動物腸道極好的保健效果,健康水平提高大幅度減少用藥成本降低死亡淘汰率。顯著提高飼料消化吸收率,減少排糞量且糞便水份少;生長加速能夠提前出欄;延長產(chǎn)蛋周期且壞蛋比例下降明顯;養(yǎng)殖環(huán)境臭味氨氣快速下降,肉蛋奶品質(zhì)改善明顯。

本產(chǎn)品由多種特異性乳酸菌、產(chǎn)酶芽孢桿菌、布拉氏酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、雙歧桿菌、丁酸梭菌與部分中草藥發(fā)酵而成的高活性發(fā)酵飼料產(chǎn)品。

【主要成分】

高濃度復(fù)合乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、淀粉酶、復(fù)合酶制劑、活性小肽、酸化劑、多維、復(fù)合氨基酸等。

【主要載體】

豆粕、魚粉、玉米粉、玉米胚芽、小麥次粉及核心原料,輔料部分為中草藥(主要有黃芪、大青葉、香附、白術(shù)、枳殼、檳榔、茯苓、金銀花、甘草等18味,20211月份再次升級后本品每袋不少于3公斤中草藥)

【規(guī)格指標(biāo)】

粗蛋白≥18%;粗脂肪≥5%;粗灰分≤6%;有效活菌數(shù)不同儲存時間在20-200CUF/g。包裝規(guī)格為20公斤/袋。本產(chǎn)品復(fù)合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。  

打開多功能生物發(fā)酵活菌肽香氣四溢并可以長時間保持,多功能生物發(fā)酵活菌肽包裝內(nèi)物料,顏色會隨著時間長短而有所變化,樣品打開后由于接觸空氣在一周左右可能會霉變,請及時飼喂或者丟棄。產(chǎn)品打開包裝后要及時密封,并請在7-15天內(nèi)喂完,以免接觸空氣后產(chǎn)生霉變影響質(zhì)量。

【產(chǎn)品功效】

1.維護腸道粘膜健康,促進(jìn)亞健康動物群體快速改善,提高畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,對比提高日增重。

2.所選的有益菌的代謝產(chǎn)物可迅速彌補消化道中內(nèi)源酶的不足,維護腸道微生態(tài)平衡,降低腸道負(fù)擔(dān),利于營養(yǎng)的吸收,防止畜禽營養(yǎng)性腸道健康問題的發(fā)生。

3.預(yù)防幼小畜禽由于更換飼料、抓捕、運輸?shù)却碳ば砸蛩卦斐傻膽?yīng)激反應(yīng)。

4.提高鈣、磷、鐵等元素與有機微量元素的吸收,增加畜禽排卵數(shù)量,提高畜禽的產(chǎn)仔(產(chǎn)蛋)數(shù)量。

5.提高飼料消化利用率,促進(jìn)飼料中碳水化合物的分解,促進(jìn)飼料中非蛋白氨轉(zhuǎn)化為高品質(zhì)蛋白質(zhì),提高飼料利用率,提高增重和降低料肉比。

6.提高瘦肉率,降低背膘厚度,使臀肌、腿肌飽滿發(fā)達(dá),形體豐滿結(jié)實,快速清除藥殘,改善酮體品質(zhì)和風(fēng)味,提高屠宰瘦肉率。

7.運用本品后輕度霉變飼料可以不再需要添加脫霉劑產(chǎn)品,本品的活性微生物代謝產(chǎn)生霉菌抑制復(fù)合物,有效抑制霉菌的生長,降低霉菌毒素的產(chǎn)生,降解部分霉菌毒素,達(dá)到解毒效果。較重霉變飼料建議不要使用或者另外添加脫霉劑。

8.改善養(yǎng)殖環(huán)境,快速降低養(yǎng)殖環(huán)境臭味和氨氣;減少動物糞便排泄量,糞便自然成形并減少糞便含水量,加快動物糞便自然發(fā)酵速度。


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客戶反饋使用后蛋雞增產(chǎn)明顯

【用法用量】

豬各階段、牛羊、雞鴨鵝家禽與特種養(yǎng)殖上均可使用。混合飼料中飼喂,也可以單獨少量直接補充灑在料槽中飼喂。由于本品1公斤相當(dāng)于約1.5~2公斤全價飼料能量,在每噸全價飼料中添加本品1包(20公斤)的情況下,可以減少全價飼料40公斤(1包)的使用量。

1.養(yǎng)豬上的運用:日常中每噸飼料使用本品1包(20公斤),初次使用與在周圍疫情嚴(yán)重、泌乳期、出欄前1個月可以增加2-4倍的使用量。仔豬、肉豬、母豬各階段都可以使用,用藥和免疫期間不需要停止無副作用。可以與部分全價飼料簡單混合后進(jìn)入自動供料系統(tǒng)中運用。

2.家禽上的運用:每噸飼料使用本品1包(20公斤),初次使用與在周圍疫情嚴(yán)重、蛋禽、出欄前1個月可以增加2-3倍的使用量。

3.牛羊上的運用:每1噸精飼料中使用本品3-5包。

4.特種動物養(yǎng)殖上的運用:每1噸飼料中添加本品2包,出欄前一個月增加一倍的使用量;部分昆蟲養(yǎng)殖上運用本品也有恢復(fù)腸道健康和解決一些疑難問題。

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5、直接撒喂方法:如果混料不方便等,可以將本產(chǎn)品單獨直接灑到畜禽養(yǎng)殖區(qū)投喂,撒喂比例按照1噸飼料運用本品1包的使用量飼養(yǎng)區(qū)域,盡量撒散開確保每只畜禽都能夠吃到。由于本產(chǎn)品非常香醇可口,畜禽都會搶吃干凈。每天撒喂1次即可。

6、飲水中運用本產(chǎn)品的方法:規(guī)模養(yǎng)殖場自動飲水系統(tǒng)的操作需要將本產(chǎn)品1包放入網(wǎng)紗袋內(nèi),浸入到1噸水中來回揉搓3分鐘以上,大部分本產(chǎn)品會融入水中,剩余不溶解的殘渣直接投喂或者拌料。每噸飲水中添加1公斤紅糖并且靜止半小時以上再給動物飲水效果更好;小規(guī)模養(yǎng)殖場或者不是自動飲水的養(yǎng)殖場,將本產(chǎn)品1包直接倒入到1噸飲水中后攪動一下給動物飲用即可(加入1公斤紅糖靜止半小時以上效果更好)。本產(chǎn)品益生菌數(shù)量多,且中草藥也會大部分會釋放出來,因此飲水也是能夠達(dá)到很不錯的效果。

【視頻】部分發(fā)酵飼料養(yǎng)豬雞鴨帶給你無臭味健康無抗養(yǎng)殖效果

廣西助農(nóng)畜牧科技有限公司提供全方位支撐

2020年已全面禁抗,我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長行為將是違法,否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動物生長又能夠形成無抗養(yǎng)殖呢?其實中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為,特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處,這個實施方案比你想象中效果更好,運用的沒有不被效果折服的,值得嘗試驗證

我們的技術(shù)僅需在出欄前半個月左右運用益生菌+酶制劑+中草藥相關(guān)的無違禁安全產(chǎn)品,肉質(zhì)改善非常顯著,且可以批量化生產(chǎn)。

目前我們已經(jīng)有了成熟的技術(shù)、產(chǎn)品和運用方案,且有大量成功案例,可以在短時間、批量化、安全無違禁地為您的養(yǎng)殖場生產(chǎn)出高品質(zhì)的家畜、家禽、水產(chǎn)產(chǎn)品。

規(guī)模養(yǎng)殖場養(yǎng)殖公司我們提供產(chǎn)品樣品、驗證效果和通過檢測后您再放心地規(guī)模化運用。

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