γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、改善腦機能、增強記憶、抗焦慮等生理功能（Kantachote等，）。GABA作為飼料添加劑，能夠提高動物抗應(yīng)激能力，改善胴體品質(zhì)和提高生產(chǎn)性能（汪祥燕等)。潘雪梅等研究發(fā)現(xiàn)，GABA可以緩解奶牛夏季的熱應(yīng)激，提高奶牛免疫能力和機體的抗氧化能力。Park等研究結(jié)果表明，GABA作為飼料添加劑能顯著提高蛋雞的生產(chǎn)能力，改善雞蛋品質(zhì)。常見的生產(chǎn)GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌（Kang等）。管軍軍等認(rèn)為，乳酸菌是定植在動物腸道中的益生菌，有利于動物的腸道健康，常被用于制備發(fā)酵飼料，有助于動物的健康養(yǎng)殖。徐秀景等研究表明，乳酸菌發(fā)酵制備的固態(tài)發(fā)酵飼料，能夠改善豬肉的品質(zhì)，提高育肥豬的生長性能。乳酸菌與GABA的聯(lián)合生產(chǎn)，能夠顯著改善飼料的營養(yǎng)品質(zhì)。沈雪嬌等研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)GABA的短乳桿菌P-14發(fā)酵飼料應(yīng)用于育肥豬的飼養(yǎng)，能提高其生產(chǎn)性能，改善豬肉的品質(zhì)，提高飼料的報酬率。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842是一種在食品加工領(lǐng)域重要的益生菌，在乳制品和功能飲料加工過程中已展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景（毛雪等）。在飼料加工領(lǐng)域，保加利亞乳桿菌ATCC 11842也具有良好的應(yīng)用前景。本研究通過探索保加利亞乳桿菌ATCC 11842生物合成GABA的規(guī)律，為生產(chǎn)富含GABA的發(fā)酵飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

GABA標(biāo)準(zhǔn)品、MRS培養(yǎng)基和谷氨酸鈉均購于北京某科技有限公司；

苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸鈉、氫氧化鈉和無水乙醇均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

保加利亞乳桿菌ATCC 11842保藏于江漢大學(xué)湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心食品加工實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1600 紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；

TG165 型離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；

HH-2 型水浴鍋：國華電器有限公司；

SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)與 GABA 生物合成方法

菌體培養(yǎng)方法：保加利亞乳桿菌ATCC 11842活化培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃；保加利亞乳桿菌ATCC 11842生長培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，接種量為2%；生長液體培養(yǎng)基置于50mL離心管，裝液量為48mL，調(diào)整液體培養(yǎng)基pH，控制培養(yǎng)溫度，厭氧靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)36h；每個樣品重復(fù)3次。

GABA生物合成方法：在菌體生長液體培養(yǎng)基中添加0.25g谷氨酸鈉底物，調(diào)整液體培養(yǎng)基pH，控制培養(yǎng)溫度，生物轉(zhuǎn)化48h；每個樣品重復(fù)3次。

1.3.2 菌體生物量測定方法

定時取0.5mL發(fā)酵培養(yǎng)基，6000r/min離心15min，棄上清液，用0.5mL無菌水懸浮菌體，在600nm條件下測定菌體光密度值（吳軍林等）。在600nm波長條件下，繪制菌體生物量與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出培養(yǎng)基中濕菌體的濃度。

1.3.3 GABA 樣品制備及其檢測方法

GABA樣品制備：取1mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基于1.5mL離心管，6000r/min離心10min，得到的上清液用于GABA含量的檢測。

檢測方法：取0.3mL上清液于25mL離心管中；依次加入0.2mL的0.2M硼酸鹽緩沖液（pH9.0），1mL的6%苯酚溶液，0.8mL的5%次氯酸鈉溶液，充分振蕩混勻；置于沸水浴中保持10min；然后迅速置于冰浴中保持15min；劇烈振蕩至顯示藍(lán)色；最后加入2mL的60%乙醇溶液；在645nm波長條件下檢測光密度值（Zhang等）。

2.結(jié)果與分析

乳酸菌生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生物合成GABA分為兩個階段。第一階段為乳酸菌的生長階段，在此階段需要提供乳酸菌良好生長環(huán)境，使乳酸菌達(dá)到最大的生物量；第二階段是GABA的生物合成階段，在此階段需要控制谷氨酸脫羧酶良好的活性環(huán)境，谷氨酸鈉在谷氨酸脫羧酶的催化作用下生物合成GABA（Ttt等）。Shi等研究表明用短乳桿菌靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA有兩個關(guān)鍵的控制因素，一是pH控制在4.5，二是溫度控制在45℃。Peng等研究結(jié)果也表明分步控制溫度和pH條件，用短乳桿菌CGMCC 1306生物轉(zhuǎn)化谷氨酸能獲得良好的轉(zhuǎn)化效率。因此，本研究探索分兩階段分別控制菌株的生長和GABA的生物合成，以期提高GABA的產(chǎn)量。

2.1 pH 和溫度對菌株生長的影響

由圖1可知，pH能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36h時，pH為5、6、7、8、9時的菌體生物量分別為11.60、17.10、15.58、13.93、9.48g/L。pH高于9時，菌株的生長受到顯著抑制。pH為6時菌株的生長最佳。終產(chǎn)物乳酸的積累是抑制乳酸菌生長的重要原因，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH會影響乳酸菌生長。閆征等研究表明，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，乳酸菌在pH6和pH6.5條件下，表現(xiàn)出較好的生長。楊靜等的研究結(jié)果也表明，乳酸菌生長的最適pH為5.5~7.0。

由圖2可知，溫度能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長。在菌株生長36h時，溫度為25、30、35、40、45℃時的菌體生物量分別為13.60、15.44、16.90、15.62、5.40g/L。溫度高于45℃，菌株生長受到明顯抑制。其中35℃是菌株生長的最佳溫度。王奎明研究結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中和37℃條件下生長良好。培養(yǎng)基組分也會影響保加利亞乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度。曾少葵等以牡蠣酶解液為原料，保加利亞乳桿菌的最適生長溫度為40℃。

2.2 pH 和溫度對 GABA 生物合成的影響

pH和溫度會影響酶分子的活性結(jié)構(gòu)以及酶分子與底物的結(jié)合（周文斯；陳穩(wěn)等）。調(diào)控反應(yīng)的溫度和pH對谷氨酸脫羧酶活性有重要影響，進(jìn)而影響GABA的生物合成（Wu等；時粲等）。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS液體培養(yǎng)基中生長36h時，培養(yǎng)基pH降為6.0，當(dāng)添加0.25g谷氨酸鈉后，培養(yǎng)基pH變?yōu)?.5。在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵液的pH分別至5、6、7、8、9，溫度為35℃，生物轉(zhuǎn)化48h后，比較GABA的產(chǎn)量。由圖3可知，pH能顯著影響GABA的產(chǎn)量。在pH為5、6、7、8、9五個不同條件下GABA產(chǎn)量分別為3.25、3.30、3.75、5.0、3.71g/L。其中pH為8時GABA生物合成量最高。隨著菌株的生長，菌株產(chǎn)酸也會使發(fā)酵液的pH降低。孟丹等研究表明，乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH為6.5，其發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為0.22g/L。曾林等從四川泡菜中分離出一株具有產(chǎn)GABA能力的植物乳桿菌BC114，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，其最佳pH為5.50，GABA產(chǎn)量為3.82g/L。

由圖4可知，溫度能顯著影響GABA的產(chǎn)量。在溫度為25、30、35、40、45℃條件下的GABA產(chǎn)量分別為2.57、2.69、3.33、4.77、3.96g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳溫度。韓昱姝等從泡菜中篩選出一株短乳桿菌LF-fb-017，其GABA產(chǎn)量可達(dá)1.68g/L，其最佳生物轉(zhuǎn)化溫度為37℃。Park等研究結(jié)果也表明，乳酸菌來源的谷氨酸脫羧酶最佳活性溫度為41℃。

2.3 優(yōu)化前后 GABA 產(chǎn)量的比較

參照前期研究方法，保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉合成GABA，在自然pH和恒溫30℃條件下，GABA產(chǎn)量為2.36g/L（Wang等）。用兩階段調(diào)控生物合成GABA的方法，菌株在初始pH6.0，溫度35℃條件下生長36h，再調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0，溫度調(diào)整至40℃，生物轉(zhuǎn)化48h，GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98g/L，如圖5。優(yōu)化后GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前GABA的產(chǎn)量提高了153.39%。張竺英等（2014）從豆豉中篩選的產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15，該菌株在含1％（W/W）谷氨酸鈉的MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量達(dá)到0.161g/L。史曉萌等從哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出一株乳酸乳球菌KCH1，GABA產(chǎn)量達(dá)329.81mg/L。吳非等利用紫外線對GABA高產(chǎn)菌株保加利亞乳桿菌L2進(jìn)行誘變處理，獲得高產(chǎn)GABA突變菌株L2-4，其在含有1%L—谷氨酸改良MRS培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量達(dá)到4.235g/L。因此，保加利亞乳桿菌ATCC 11842 GABA的合成能力顯著高于上述報道的乳酸菌株。

3.結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，對菌株生長和GABA生物合成的pH和溫度進(jìn)行兩階段分開控制，能顯著提高GABA的產(chǎn)量。菌株在初始pH 6.0，溫度35℃條件下生長36h后，再調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0，溫度40℃，GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98g/L。優(yōu)化后GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前GABA的產(chǎn)量提高153.39%。