無抗發酵飼糧對豬小腸黏膜形態和杯狀細胞的影響

2021-02-03 10:32:51 點擊：

摘要：本試驗旨在研究無抗發酵飼糧對豬小腸黏膜形態和杯狀細胞的影響。試驗選取遺傳背景相似的初生健康乳豬 120 頭，隨機分為試驗組和對照組，每組 6 個重復，每個重復 10 頭豬。對照組飼喂含抗生素的基礎飼糧，試驗組飼喂以 10% 發酵飼糧代替部分無抗生素基礎飼糧的試驗飼糧，營養和能量水平調到與對照組相當。結果表明：1）試驗組和對照組在小腸黏膜形態上有一定的差異。 2）在 44日齡時，試驗組空腸絨毛高度比對照組提高 7.19%（P ＜0.05）。在 44和 75日齡時，試驗組回腸絨毛高度顯著高于對照組（ P ＜ 0.05）。 3）對照組十二指腸、空腸、回腸隱窩深度均高于試驗組，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。4）在 44 日齡時，試驗組回腸絨毛高度 / 隱窩深度（V/C）比對照組提高 17.18%（P ＜ 0.01）。5）在 44 日齡時，對照組十二指腸、空腸和回腸黏膜上皮間杯狀細胞數量極顯著高于試驗組（P ＜ 0.01）。在 75 日齡時，對照組十二指腸黏膜上皮間杯狀細胞數量極顯著高于試驗組（P ＜ 0.01）。綜上所述，無抗發酵飼糧能改善小腸黏膜形態，增大吸收面積，從而促進小腸對營養物質的吸收。

關鍵詞：無抗發酵飼糧；豬；小腸黏膜；杯狀細胞

抗生素在飼糧中的廣泛使用，造成細菌耐藥性、食品安全、公共衛生和環境污染等問題，農業部農辦醫 [2018]13 號明確指出 2020 年藥物飼料添加劑全部退出，飼糧中禁止添加抗生素。因此，研發安全、無殘留、能有效替代抗生素的新型飼料添加劑已成為發展趨勢。由于益生菌發酵飼糧通過 1 種或多種益生菌的發酵，飼糧中富含更多的活性益生菌菌體、有益代謝產物，同時可消除飼糧中的抗營養因子，能夠促生長和維持動物健康，而益生菌是替代抗生素潛力最大的一種添加劑。在動物機體中，小腸是營養物質消化吸收的主要場所，小腸黏膜狀態與營養物質的吸收密切相關，腸道杯狀細胞是一種分泌細胞，其分泌的黏蛋白（MUC）和三葉肽因子等形成腸道黏液層，對維持腸道黏膜穩態起著重要的作用。本試驗通過觀察不同日齡豬的腸道黏膜形態，測量小腸黏膜的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度 / 隱窩深度（V/C）及腸絨毛上皮間杯狀細胞的數量，來探討無抗發酵飼糧對豬腸道黏膜的影響，為其代替市場上含有抗生素的飼糧提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設計

選取 120 頭體重相近的 “長 × 大”初生健康乳豬，隨機分為試驗組和對照組，每組 6 個重復，每個重復 10 頭豬，試驗分為 3 個階段即哺乳階段（0 ～ 28 日齡）、斷奶階段（29 ～ 44 日齡）、保育階段（45 ～ 75 日齡），試驗周期共 75d。各組試驗仔豬以窩為單位，7 ～ 28 日齡飼喂哺乳仔豬飼糧，29 日齡轉群至保育舍，飼喂斷奶仔豬飼糧至試驗結束。對照組和試驗組同舍飼養，各重復室內均勻分布，條件盡可能一致，自由采食，自主飲水。

1.2 試驗飼糧

無抗發酵飼糧的生產方式為：將玉米與豆粕按各 50% 的比例進行稱量、粉碎和混合，作為發酵底物；發酵菌種由鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌組成，料水比為 1.00 ∶ 0.45；35℃ 厭氧發酵 60h，委托新鄉市酵守康飼料有限公司生產。試驗組飼糧加入以 10% 發酵飼糧來替代部分不含抗生素基礎飼糧，對照組飼喂含抗生素的基礎飼糧（50mg/kg 金霉素和 100mg/kg 吉他霉素），并調整試驗組各階段的飼糧營養水平與對照組相同。玉米－豆粕型混合飼糧發酵前后營養水平見表 1。哺乳仔豬和斷奶仔豬基礎飼糧組成及營養水平分別見表 2、表 3。

1.3 樣品采集與處理

在仔豬出生后的第 5、15、25、44 和 75 分別于 2 組的每個重復中隨機抽取 1 頭豬稱重后宰殺，取十二指腸、空腸和回腸各段約 2cm，于 4% 多聚甲醛液中固定。

1.4 組織切片制作

樣品在 4% 多聚甲醛溶液中固定 48h 后，將組織修整成 7mm 小塊；自來水沖洗固定 12h；常規梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋后切片，進行蘇木精－伊紅（HE）染色和高碘酸雪夫氏（PAS）染色。

1.5 腸黏膜檢測指標

在各階段的十二指腸、空腸和回腸每個樣本中選取 5 張切片，低倍鏡下每張切片選出 5 個不同視野觀察腸黏膜形態，測量絨毛高度、隱窩深度、V/C 和杯狀細胞數量。觀察過程中應注意所選取的腸絨毛長度應該基本一致，應用 Nikon50i 顯微鏡照相處理軟件進行拍照。

1.6 統計分析

試驗數據用平均值 ± 標準差表示，采用 SPSS 19.0 軟件進行 t 檢驗分析，以P ＜ 0.05 表示差異顯著，以P ＜ 0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 無抗發酵飼糧對豬小腸黏膜形態的影響

試驗組和對照組小腸黏膜形態變化上有一定的差異。由圖 1 可見，2 組十二指腸不同的變化表現為：試驗組腸絨毛較長，呈明顯的葉狀結構，絨毛的游離端明顯膨大。絨毛體至腺體部散在少量杯狀細胞，腸腺中的杯狀細胞增多。腸絨毛的固有層中有較多散在的淋巴細胞。而對照組腸絨毛較短，呈指狀，絨毛的游離緣有較多的杯狀細胞分散在柱狀細胞之間。2 組豬空腸不同的變化表現為：試驗組腸絨毛較粗，固有層發達，其中彌散大量淋巴細胞，腸腺部的固有層也有大量淋巴細胞，形成淋巴組織樣結構。對照組腸絨毛較細，固有層不發達，腸腺部固有層內淋巴細胞較少，呈散在狀，沒有形成淋巴組織樣結構。 2 組回腸不同的變化表現為：試驗組回腸絨毛較稀疏，絨毛的固有層較發達，其中分布大量淋巴細胞。腸腺基部的固有層中有大量淋巴細胞集聚，并突破黏膜肌層，在固有層和黏膜下層形成集合淋巴小結樣構造。對照組回腸絨毛細長，數量較多，排列較密。在黏膜下層中見有淋巴小結形成，呈現孤立淋巴小結樣構造。

2.2 無抗發酵飼糧對豬小腸絨毛高度的影響

如表 4 所示，自 25 日齡開始，試驗組十二指腸絨毛高度整體都略高于對照組，但沒有達到差異顯著的水平（P ＞ 0.05）。在 44 日齡時，試驗組空腸絨毛高度比對照組提高 7.19 %（P ＜ 0.05），其他日齡組間差異不顯著（P ＞ 0.05）。在 44 和 75 日齡時，試驗組回腸絨毛高度顯著高于對照組（P ＜ 0.05），其他日齡組間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.3 無抗發酵飼糧對豬小腸隱窩深度的影響

如表 5 所示，對照組十二指腸、空腸、回腸隱窩深度均較高于試驗組，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。在 75 日齡時，試驗組十二指腸和回腸隱窩深度比對照組分別降低 6.40% 和 5.98%，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.4 無抗發酵飼糧對豬小腸 V/C 的影響

如表 6 所示，試驗組十二指腸、空腸和回腸 V/C（除 15 日齡十二指腸外）均高于對照組，但差異不顯著（P ＞ 0.05）。其中在 44 日齡時，試驗組回腸 V/C 比對照組提高 17.18%，差異極顯著（P ＜ 0.01）。

2.5 無抗發酵飼糧對豬小腸黏膜上皮間杯狀細胞數量的影響

小腸黏膜上皮的杯狀細胞分散在柱狀細胞之間，但也有連續排列的杯狀細胞，一般靠近腸腺部位較為集中，胞核位于基底部，呈高腳杯狀，被 PAS 染色法染成深紅色（圖 2）。在 25 日齡時，試驗組和對照組十二指腸絨毛體的中、下兩側部至腸腺部見有較多的杯狀細胞，絨毛頂端的杯狀細胞較少，杯狀細胞分泌的黏液被染成深紅色覆蓋在腸上皮表面，以對照組較顯（圖 2-A、圖 2-B）。在 75 日齡時，試驗組空腸腸絨毛變短，但較粗，排列較密集。杯狀細胞多分散于腸絨毛體兩側的吸收細胞間，絨毛頂端少有杯狀細胞（圖 2-C）。對照組空腸絨毛較粗大，呈葉狀。在絨毛兩側的吸收細胞之間杯狀細胞數量增多，有的呈連續排列，腸腺部杯狀細胞較為集中（圖 2-D）。在 75 日齡時，回腸絨毛變短，較粗，絨毛的固有層中有大量淋巴細胞，絨毛頂端有腸上皮脫落現象（圖 2-E、圖 2-F）。試驗組腸絨毛呈錐狀，絨毛的兩側到腸腺部見有大量杯狀細胞，腸腺腔的上皮細胞也被 PAS 染成深紅色（圖 2-E）。對照組回腸絨毛呈短柱狀，較稀疏，絨毛的中、下部和腸腺部有較多的杯狀細胞，至絨毛頂端脫落（圖 2-F）。

如表 7 所示，在 44 日齡時，對照組十二指腸、空腸和回腸黏膜上皮間杯狀細胞數量極顯著高于試驗組（P ＜ 0.01）。在 75 日齡時，對照組十二指腸黏膜上皮間杯狀細胞數量極顯著高于試驗組（P ＜ 0.01）。其他日齡組間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

3 討論

小腸是豬對營養物質消化和吸收的主要場所，其功能的發揮與其生理結構是密切相關的，腸道屏障功能可以維持微生態的平衡，所以腸道黏膜與動物的健康至關重要，特別是小腸絨毛高度、隱窩深度、V/C 及有效的吸收面積都是衡量其消化和吸收功能高低的重要指標，腸道形態學結構的改變是造成消化吸收功能和免疫功能差異的主要原因之一。腸絨毛和微絨毛的存在極大地增加了小腸與食物的接觸表面積，腸絨毛變短時，腸上皮細胞數量隨之減少，其營養物質吸收能力降低。絨毛根部下陷至固有層形成的管形縮陷為小腸腺即隱窩，當腸道絨毛脫落，隱窩多能干細胞會分化成新的腸上皮細胞向絨毛頂端移行，形成新的絨毛。隱窩深度反映細胞的生成率，隱窩變淺表明細胞成熟率上升，分泌功能增強。V/C 下降表明小腸的消化吸收功能下降，比值升高表明消化吸收率增強。龐敏等研究表明，斷奶應激對仔豬的腸道黏膜形態有很大的影響，而飼喂益生菌發酵飼糧可以顯著提高斷奶仔豬的腸道上皮絨毛高度，且顯著提高 V/C。斷奶應激會造成仔豬的絨毛萎縮，隱窩細胞分裂過快，造成隱窩深度增加及 V/C 下降，嚴重影響小腸對營養物質的消化吸收。益生菌發酵飼糧可以提高飼糧中有機酸含量，降低 pH，進而使斷奶仔豬胃液 pH 與消化道酸度發育水平趨于穩定，減少仔豬腹瀉和增強仔豬對營養物質的消化吸收能力。益生菌發酵為減少斷奶仔豬應激提供了一種營養策略。鄧軍研究表明，同時飼喂枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌可以提高十二指腸和空腸的絨毛高度和降低空腸和回腸的隱窩深度，V/C 升高。 Feng 等研究發現，飼喂發酵豆粕配合飼料可以顯著提高斷奶仔豬小腸絨毛高度，提高 V/C。

本試驗結果顯示，在 44 日齡時，試驗組空腸和回腸絨毛高度顯著高于對照組；在 75 齡時，試驗組回腸絨毛高度顯著高于對照組；在 44 日齡時，試驗組回腸 V/C 顯著高于對照組。根據本試驗結果得出：試驗組絨毛高度、隱窩深度和 V/C 略優于對照組。其原因可能是飼糧經過益生菌發酵后，其營養成分更有益于動物機體的吸收，幾種益生菌復合發酵后隨著飼糧一同進入消化道，黏附于腸道黏膜上皮細胞，并在動物胃腸道中迅速萌發和增殖，調節胃腸道微生物生態平衡，且發酵產物中的有機酸、氨基酸和小肽等代謝產物能刺激腸絨毛的生長發育和腸上皮細胞的更新，增加絨毛高度，提高 V/C，進而促進小腸對飼糧中營養物質的消化吸收。此外，益生菌還能調節腸道黏液的分泌，上調腸道上皮細胞緊密連接蛋白和細胞骨架蛋白的表達，增強腸上皮細胞間的緊密連接，維持腸道黏膜屏障的完整性。小腸杯狀細胞起初分化于小腸腺，之后向絨毛頂端或腸上皮不斷遷移分化，最后脫落至腸腔死亡，為杯狀細胞的一個分泌周期。杯狀細胞是一種典型的黏液細胞，其成分主要是黏蛋白，黏蛋白顆粒分泌到胞外與水、無機鹽等合成黏液附著在腸黏膜表面形成腸道黏液層，有潤滑保護作用，并參與多種腸道疾病的發生發展。但腸絨毛杯狀細胞數量增多，分泌過量的黏液覆蓋在腸黏膜表面，會使消化酶的分泌減少，腸黏膜的吸收面積減少，再加之大量黏液被覆在腸上皮細胞的表面，在腸上皮細胞與腸內容物之間形成了一道屏障，減少了腸上皮細胞與營養物質接觸的機會，故在很大程度上降低了腸道的吸收面積，導致營養物質的吸收障礙，嚴重時可引起腹瀉。張獻彩發現發生糖尿病小鼠的小腸絨毛易被破壞，糖尿病組中杯狀細胞的分泌物比同月份正常對照組顯著增加。本試驗結果顯示，在 44 日齡時，對照組十二指腸、空腸和回腸杯狀細胞數量極顯著高于試驗組；在 75日齡時，對照組十二指腸杯狀細胞數量極顯著高于試驗組。分析原因可能是飼喂抗生素飼糧的對照組豬在斷奶后，由于受到斷奶應激的影響，腸道黏膜受損，破壞小腸絨毛，引起炎癥反應，使緩激肽和組織胺釋放增多，這些刺激可直接引起杯狀細胞分泌增多，而無抗發酵飼糧中的益生菌能與黏蛋白一起作為腸道黏膜屏障，阻礙致病菌進入體內，并能調節杯狀細胞的產生和腸液中黏蛋白的含量，使腸道中杯狀細胞的數量趨于穩定，維持腸道結構的完整。此外，發酵產物中的一些小分子有益代謝產物能自由通過黏液層，更有利于機體的吸收。

4 結論

綜上所述，飼喂無抗發酵飼糧在哺乳、斷奶和保育階段對豬機體無不良影響，并可在一定程度上改善腸道黏膜形態，提示無抗發酵飼糧可以替代含抗生素的飼糧應用于豬生產中。

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