酵母壁多糖對斷奶仔豬腸道揮發(fā)性脂肪酸和微生物菌群的影響
導(dǎo)讀
近年來，隨著畜牧業(yè)和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，養(yǎng)豬業(yè)正逐漸成為一個技術(shù)密集和資金密集的行業(yè)。既要提供優(yōu)質(zhì)豬肉，又要不危害環(huán)境衛(wèi)生和人類健康是近年來養(yǎng)豬業(yè)要面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于抗生素類飼料添加劑的亂用、濫用，抗生素殘留、細(xì)菌多重耐藥性和環(huán)境污染等問題日漸加劇，人們迫切需要尋找到合適的抗生素替代品。酵母壁多糖作為功能性寡糖類物質(zhì)，其主要成分為β-葡聚糖和甘露寡糖。大量研究表明，寡糖類物質(zhì)能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，并能一定程度上提高機體的免疫性能。同樣，酵母壁多糖也被證明能夠提高畜禽的生長性能和免疫功能，并能改善腸道健康，且無害無殘留。但是，它是通過怎樣的途徑來改善機體腸道健康，對斷奶仔豬腸道菌群又有怎樣的影響呢？ 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是微生物厭氧發(fā)酵過程的重要中間產(chǎn)物，后腸段是仔豬腸道菌群的豐富部位。對于單胃動物，VFA 產(chǎn)生的主要部位是結(jié)腸，因為結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌首先與小腸內(nèi)未消化的復(fù)雜碳水化合物接觸，發(fā)酵活性最強。其次，結(jié)腸段比盲腸長，微生物含量相對來說較多。本試驗旨在研究酵母壁多糖對斷奶仔豬腸道VFA 和微生物菌群的影響，確定其在斷奶仔豬中應(yīng)用的最適添加水平，并為酵母壁多糖在仔豬飼糧中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1 試驗材料
酵母壁多糖來源于拓普生物科技有限公司，其主要成分為甘露寡糖（23.45％） 和β-葡聚糖（39.24％），粗蛋白質(zhì)含量為26.30％、粗灰分含量為3.30％、水分含量為5.35％。
1.2 試驗動物和分組設(shè)計
選取180頭遺傳背景一致、健康狀況良好、胎次和體重接近的21 日齡斷奶仔豬，采用單因素試驗設(shè)計方法，按完全隨機區(qū)組分為4個組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)9 頭仔豬。4個組試驗豬分別飼喂對照飼糧（未添加酵母壁多糖）、0.15％ 酵母壁多糖飼糧、0.30％酵母壁多糖飼糧和0.45％酵母壁多糖飼糧。試驗期為21ｄ。
1.3 試驗飼糧和營養(yǎng)水平
仔豬飼喂玉米－豆粕型飼糧，飼糧配方參照NRC（2012） 和我國《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（ NY/T65-2004）配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表１。
1.4 飼養(yǎng)管理
仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、乳頭式飲水器的保育舍。試驗開始前對豬舍進(jìn)行徹底清理消毒。試驗過程中，每日飼喂仔豬4 ～5 次。所有仔豬自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理措施、免疫程序按豬場常規(guī)管理程序進(jìn)行
1.5 樣品采集及處理
在試驗第21天，從每個重復(fù)中選取1 頭接近平均體重且健康狀況良好的仔豬，肌內(nèi)注射4％戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。待麻醉完全后，采用頸靜脈放血的辦法將其處死。剖開腹腔，迅速分離結(jié)腸，剪取帶有食糜的腸段，結(jié)扎固定取樣部位的兩端，包被腸道食糜樣后，置于液氮中迅速冷凍，用于結(jié)腸VFA含量分析。
另取盲腸中段腸管，兩端雙線結(jié)扎，錫箔紙包被后，用保鮮膜連同棉線一端裹好，另一端貼好標(biāo)簽紙，迅速置于液氮中冷凍后， 于-80 ℃ 保存待測。
1.6 測定指標(biāo)及方法
1.6.1 結(jié)腸VFA含量的測定
將樣品解凍，參考耿梅梅等方法，準(zhǔn)確稱取1.0ｇ 結(jié)腸內(nèi)容物于EP 管中。加入1mL 超純水，漩渦振蕩致內(nèi)容物混合均勻。以15000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上清，按體積比9∶1比例添加25％偏磷酸，冰水浴中處理3ｈ。然后通過氣相色譜儀利用外標(biāo)法測定各樣品中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量，并計算相應(yīng)總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量。
1.6.2 盲腸細(xì)菌計數(shù)
盲腸大腸桿菌、沙門氏菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和總菌數(shù)采用平板培養(yǎng)法測定。取盲腸內(nèi)容物樣品，在無菌操作臺內(nèi)室溫解凍。稱取盲腸內(nèi)容物0.5ｇ 于無菌青霉素瓶中，加入滅菌后的生理鹽水5ｍＬ，漩渦振蕩器上振蕩3 ～ 5 min，然后用微量移液槍準(zhǔn)確吸取稀釋液500μＬ 至盛有4.5 mL 生理鹽水的無菌青霉素瓶中，振蕩1～ 2 min，制成10-1稀釋液，繼續(xù)重復(fù)以上稀釋步驟，依次進(jìn)行10-2～ 10-6倍比稀釋。
將盲腸內(nèi)容物稀釋液分別接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿上。大腸桿菌、乳酸桿菌、沙門氏菌、雙歧桿菌和總菌分別使用伊紅美蘭、MRS、HE、BBL和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，每種指標(biāo)檢測5個稀釋梯度，每個梯度3 個重復(fù)，總菌、大腸桿菌和沙門氏菌于37 ℃ 恒溫有氧培養(yǎng)24ｈ。雙歧桿菌和乳酸桿菌于37 ℃ 恒溫厭氧培養(yǎng)48 ｈ。最后取出培養(yǎng)皿，進(jìn)行菌落計數(shù)。細(xì)菌計數(shù)結(jié)果用1.0ｇ 腸道食糜中細(xì)菌數(shù)的對數(shù)值［Ig（CFU/g）］表示。
1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)用Excel2003 簡單處理后，采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析（one way ANOVA）模型進(jìn)行方差分析，差異顯著再進(jìn)行Duncan氏法多重比較，用SPSS 17.0中的曲線回歸分析（curvilinearre gression）進(jìn)行相關(guān)性分析，通過飼糧酵母壁多糖添加水平與各指標(biāo)之間的二次曲線擬合，確定最佳的回歸曲線方程，計算飼糧中酵母壁多糖最適添加水平。各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以Ｐ＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
2結(jié)果與分析
2.1 酵母壁多糖對斷奶仔豬結(jié)腸VFA的影響
由表２ 可知，與對照組相比，在飼糧中添加0.15％、0.30％和0.45％酵母壁多糖，仔豬結(jié)腸內(nèi)容物乙酸含量分別增加了27.57％、48.71％和34.46％（P<0.05）；添加0.30％ 和0.45％ 酵母壁多糖還顯著提高了仔豬結(jié)腸丙酸、丁酸的含量（P<0.05）；此外，0.45％酵母壁多糖組結(jié)腸戊酸含量顯著高于對照組（ P<0.05）。從整體上來看， 飼糧中添加0.30％和0.45％ 酵母壁多糖可顯著提高仔豬結(jié)腸內(nèi)容物TVFA含量（ P<0.05）。與對照組相比，0.30％和0.45％ 酵母壁多糖組TVFA 分別提高了49.72％ 和44.42％ （P
通過曲線擬合回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，回腸中乙酸（Y1 ）和TVFA（Y2 ）含量與飼糧酵母壁多糖添加水平（X） 間均呈二次曲線關(guān)系，建立回歸方程如下：
Y1 ＝ －7513.000Ｘ2 ＋4723.203Ｘ＋
1593.519（R2 ＝ 0.677，P ＝ 0.006）；
Y2 ＝ －9497.699Ｘ2 ＋7419.340Ｘ＋
2909.547（R2 ＝ 0.727，P＝ 0.003）。
由上述回歸方程可得，當(dāng)飼糧中酵母壁多糖添加水平為0.31％時，回腸中乙酸含量值最大；當(dāng)添加水平為0.39％ 時，斷奶仔豬回腸中TVFA 含量值最大。
2.2 酵母壁多糖對斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響
由表3 可知，各組間盲腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌和總菌的數(shù)量差異不顯著（P>0.05）。但飼糧中添加0.15％、0.30％ 和0.45％ 的酵母壁多糖后，仔豬盲腸沙門氏菌數(shù)分別比對照組降低了6.12％、7.93％和9.09％ （P<0.05）。另外，添加酵母壁多糖顯著降低了仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量（P<0.05）。
通過曲線擬合回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，盲腸中沙門氏菌（Y3）與飼糧酵母壁多糖添加水平（X）間呈二次曲線關(guān)系，建立回歸方程如下：
Y3 ＝ 3.259Ｘ2－2.636X＋6.036
（R2 ＝ 0.670，P＝ 0.007）。
由該回歸方程可得出，當(dāng)飼糧中酵母壁多糖添加水平為0.40％時，盲腸中沙門氏菌數(shù)量最少。
3討 論
3.1 酵母壁多糖對斷奶仔豬結(jié)腸VFA的影響
在單胃動物整個消化道中，大腸是微生物含量最豐富的區(qū)域 。雖然這些微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素對腸道有害，但是它們維持著腸道微生態(tài)平衡，抵御外來微生物的定植，并能激活腸道免疫系統(tǒng)，更重要的是這些微生物能將復(fù)雜的碳水化合物發(fā)酵成VFA。體內(nèi)、體外試驗均證實，寡糖可被細(xì)菌降解成大量的VFA。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，添加0.30％ 和0.45％ 酵母壁多糖能顯著提高斷奶仔豬TVFA含量。潘曉東研究發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能顯著提高小鼠盲腸內(nèi)TVFA、丙酸和戊酸的含量。杭蘇琴等通過體外法研究甘露寡糖和甜菜汁對腸道微生物發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)甘露寡糖各組回腸中丙酸和丁酸的比例顯著高于對照組，甘露寡糖組乙酸比例顯著低于對照組。反觀本試驗結(jié)果，酵母壁多糖能顯著提高乙酸、丙酸和丁酸的含量，而大腸中微生物能通過利用乳酸和乙酸轉(zhuǎn)化生成丁酸，且乳酸完全發(fā)酵能產(chǎn)生大量丙酸。因此推測，酵母壁多糖可能能夠促進(jìn)乳酸利用菌的增殖來達(dá)到乳酸向丁酸轉(zhuǎn)化的效果。此外本試驗還得出，添加0.45％ 酵母壁多糖能顯著提高斷奶仔豬結(jié)腸戊酸含量。通過結(jié)腸中TVFA和乙酸含量與飼糧中酵母壁多糖添加水平得出有效回歸方程預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼糧中酵母壁多糖含量分別為0.39％和0.31％時，結(jié)腸中VFA含量較高。
3.2 酵母壁多糖對斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響
正常情況下，動物腸道內(nèi)各菌群相互依存、相互拮抗維持腸道的動態(tài)平衡。但外界環(huán)境應(yīng)激（如斷奶、溫度、轉(zhuǎn)欄等）容易破壞腸道動態(tài)平衡，導(dǎo)致腸道微生物菌群之間比例失調(diào)。研究證明，仔豬斷奶后，腸道乳酸桿菌數(shù)量下降，大腸桿菌的比例上升。添加抗生素雖能一定程度上改善仔豬腹瀉，但同樣也會破壞腸道有益菌，酵母壁多糖主要含有甘露寡糖和β－葡聚糖，飼糧中的糖類物質(zhì)對腸道內(nèi)微生物區(qū)系有一定的影響能力。早在20 多年前，甘露寡糖和果寡糖等功能性寡糖就被證實能改善人體的腸道菌群。前期動物試驗也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加0.15％、0.30％和0.45％酵母壁多糖均能夠顯著提高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量，并有降低仔豬料重比和腹瀉率的趨勢。本研究結(jié)果顯示，在斷奶仔豬飼糧中添加酵母壁多糖能顯著降低盲腸沙門氏菌和大腸桿菌數(shù)量。這可能是由于甘露寡糖能夠被腸道微生物利用發(fā)酵并促進(jìn)VFA增加，一方面降低腸道pH，使得對酸度敏感的大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌群的生長就受到相應(yīng)地抑制；另一方面VFA具有降低氧化還原電位的作用，影響有害菌生長和代謝必須輔酶的氧化還原作用，從而抑制致病菌。薩立富關(guān)于甘露寡糖對斷奶仔豬腸道菌群影響的研究也發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能夠極顯著降低了腸道大腸桿菌的數(shù)量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能夠增強斷奶仔豬沙門氏菌和大腸桿菌的抗感染能力 。β－葡聚糖對腸道微生物也有一定的調(diào)節(jié)作用，添加β－葡聚糖提高了腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌群數(shù)量。這與本試驗的結(jié)果相一致。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加0.15％、0.30％和0.45％酵母壁多糖還能一定程度上增加盲腸內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，但差異不顯著。綜上試驗結(jié)果可以得出：酵母壁多糖能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)盲腸內(nèi)有益菌增殖，抑制有害菌增殖。且通過盲腸中沙門氏菌數(shù)與飼糧中酵母壁多糖的回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，酵母壁多糖的添加水平為0.40％ 時效果最佳。
4結(jié) 論
① 酵母壁多糖可以調(diào)節(jié)仔豬腸道VFA結(jié)構(gòu)和含量。當(dāng)飼糧中添加0.30％ 和0.45％ 酵母壁多糖時，仔豬結(jié)腸乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA的含量顯著升高。
② 酵母壁多糖對改善斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)作用。當(dāng)飼糧中添加0.35％ 和0.45％ 酵母壁多糖時，仔豬盲腸大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量顯著降低。
③ 運用回歸方程預(yù)測，酵母壁多糖在仔豬飼糧中的適宜添加量為0.31％ ～ 0.41％。
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