乳酸菌為主的發(fā)酵劑發(fā)酵中藥在仔豬上的應(yīng)用效果好
化學(xué)合成類抗生素的推廣應(yīng)用帶動(dòng)了畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，極大地推動(dòng)了規(guī)模化養(yǎng)殖的進(jìn)程，使養(yǎng)殖成本不斷降低。隨著市場(chǎng)上肉、禽、蛋、奶供過于求，人們逐漸反思化學(xué)合成類藥物飼料添加劑帶來的健康、環(huán)境等負(fù)面影響。有實(shí)驗(yàn)證明長(zhǎng)期使用或?yàn)E用抗菌素引發(fā)的耐藥菌生長(zhǎng)和抗藥基因的轉(zhuǎn)移，可能導(dǎo)致人和動(dòng)物機(jī)體免疫力下降、二次用藥增加、藥物殘留、雙重和內(nèi)源性感染等一系列問題，對(duì)健康構(gòu)成威脅。而有機(jī)酸、酶制劑、益生元、植物提取物和精油、以及微生態(tài)制劑等新型飼料添加劑可能成為抗生素等藥物飼料添加劑的替代品，從飼料源頭消除安全隱患。
一、中藥發(fā)酵
中藥發(fā)酵是利用微生物的生長(zhǎng)代謝和生命活動(dòng)來炮制中藥的一種藥物加工技術(shù)，其本質(zhì)就是利用微生物在生長(zhǎng)代謝過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（酶和有機(jī)酸等），對(duì)外源性中藥底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾和轉(zhuǎn)化。
（一）中藥發(fā)酵的歷史
發(fā)酵作為傳統(tǒng)中藥炮制方法之一，應(yīng)用已有一千多年的歷史。它不但改變了煎、煮、熬、煉、蒸、浸等條件相對(duì)嚴(yán)苛的傳統(tǒng)工藝，而且使藥效提高、藥性發(fā)生改變。經(jīng)凈制或處理后的藥物，在相對(duì)溫和的溫度（30～37℃）和濕度（70%～80%）條件下，通過酵母、霉菌及酶等的作用，使藥物發(fā)泡、生衣的方法稱為發(fā)酵法。
（二）傳統(tǒng)中藥發(fā)酵的分類
1. 藥料與面粉混合發(fā)酵
如神曲。神曲為青篙、杏仁等藥加入面粉混合后，經(jīng)發(fā)酵制成曲劑，有消食化積、健脾胃等功效。
2. 藥料直接進(jìn)行發(fā)酵
如紅曲。紅曲為紅曲霉屬真菌接種于蒸熟的大米上發(fā)酵而成，有健脾消食、活血化瘀的功效。
（三）傳統(tǒng)中藥發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)
1. 優(yōu)點(diǎn)
條件簡(jiǎn)單溫和，原輔料多就地取材，真菌固體發(fā)酵為主，后處理烘干粉碎，易于保藏。
2. 缺點(diǎn)
（1）發(fā)酵菌種以真菌為主，相對(duì)單一，且自然條件下影響因素眾多，目的菌接種與雜菌難以控制；
（2）發(fā)酵培養(yǎng)基影響很大，不同物料組成會(huì)產(chǎn)生藥性藥效的差異，導(dǎo)致適應(yīng)證不同；
（3）發(fā)酵條件多憑經(jīng)驗(yàn)感官把握，要想嚴(yán)格控制難度很大。主觀性大，產(chǎn)品穩(wěn)定性難以保證。
（四）現(xiàn)代中草藥發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)
1. 藥物有效成分活性物質(zhì)能最大限度地得以保留提取。
2. 嚴(yán)格發(fā)酵工藝控制，減少雜菌及有害產(chǎn)物的生成。
3. 產(chǎn)生新的有效活性物質(zhì)，提升了藥效。
4. 降低藥物的毒副作用，改善適口性。
5. 提高利用價(jià)值，減少藥材浪費(fèi)，降低使用成本。
二、植物劑與微生態(tài)制劑的組合
（一）中藥及益生菌拮抗產(chǎn)毒素大腸桿菌K88體外初篩試驗(yàn)
分別利用19種中藥和8種益生菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示其中5種中藥及2種益生菌的抑菌效果較好，分別為烏梅、五倍子、黨參、石榴皮、蒲公英、植物乳桿菌0015和嗜酸乳桿菌0111。并進(jìn)一步選擇中藥烏梅、五倍子、黨參、石榴皮、蒲公英及益生菌0015、0111作為后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)篩選試驗(yàn)材料。
（二）中藥及益生菌小鼠模型復(fù)篩試驗(yàn)
采用灌胃的方式給藥，并測(cè)定給藥小鼠的生理生化指標(biāo)，來分析中藥組方是否影響乳酸菌生長(zhǎng)及乳酸菌發(fā)酵是否引起中藥成分的變化。
1. 中藥組方對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響
通過發(fā)酵前后乳酸菌數(shù)量的變化分析，表明中藥組方不影響乳酸菌生長(zhǎng)。
2. 乳酸菌發(fā)酵對(duì)中藥成分的影響
單味中藥，如烏梅的有效成分主要是草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸，蒲公英的有效成分主要是黃酮類（木犀草素、槲皮素）、酚酸類（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸），五倍子的有效成分主要是鞣酸（單寧酸）和沒食子酸，而嗜酸乳桿菌的有效成分主要是乳酸、乙酸和草酸等有機(jī)酸。
（1）乳酸菌發(fā)酵對(duì)蒲公英中綠原酸、木犀草素成分的影響
中藥水提與中藥發(fā)酵中的游離木犀草素、綠原酸含量相差不大，基本無影響，且重復(fù)性較好。表明乳酸菌發(fā)酵未改變蒲公英中有效成分木犀草素、綠原酸的含量。
（2）乳酸菌發(fā)酵對(duì)蒲公英中綠原酸成分的影響
中藥水提和中藥發(fā)酵中綠原酸含量相差不大。乳酸菌發(fā)酵未改變蒲公英有效成分綠原酸的含量。
（3）乳酸菌發(fā)酵對(duì)蒲公英中有機(jī)酸成分的影響
發(fā)酵后部分成分發(fā)生變化，除蘋果酸含量有所降低外，各種有機(jī)酸均有不同程度的升高，其中檸檬酸和琥珀酸含量增加較多，分別為中藥水提的1.28和2.51倍。
（3）乳酸菌發(fā)酵對(duì)蒲公英中新出現(xiàn)的成分的影響
五倍子水提液在20min左右出現(xiàn)了峰，發(fā)酵前出現(xiàn)的較高未知峰來源于五倍子。五倍子中含有豐富的單寧酸。以單寧酸為對(duì)照品，進(jìn)行高效液相色譜分析，分析圖譜可知，發(fā)酵前的未知峰為單寧酸。
隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵前后未知峰此消彼長(zhǎng)，7-9h變化較快，發(fā)酵12h后，發(fā)酵前峰降到最低，發(fā)酵后峰達(dá)到最高。說明發(fā)酵前后未知峰存在某種轉(zhuǎn)化關(guān)系。五倍子主要成分為單寧酸和沒食子酸，且兩者之間存在轉(zhuǎn)化關(guān)系。
乳酸菌0111在12h單寧酶活力也達(dá)到最高為758.76U/L。單寧酶活力的變化趨勢(shì)與乳酸菌活菌數(shù)變化趨勢(shì)基本相同。說明，嗜酸乳桿菌0111能夠產(chǎn)生單寧酶，且單寧酶的活力與乳酸菌活菌數(shù)成正相關(guān)。從單獨(dú)乳酸菌發(fā)酵液中檢測(cè)不到單寧酶的酶活，說明在五倍子單寧存在條件下，可誘導(dǎo)該株乳酸菌產(chǎn)生單寧酶，而乳酸菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境加快了單寧酸的水解轉(zhuǎn)化。該菌已申報(bào)專利。沒食子酸具有良好的消炎、殺菌、抗病毒等功效。新峰中其他具體成分仍在解析中。
三、中藥乳酸菌發(fā)酵劑在仔豬上的應(yīng)用
按照品種相同、胎次相近、體重相近的原則，選取21-28日齡斷奶仔豬，共75頭，分5個(gè)試驗(yàn)組,每組3個(gè)平行，每個(gè)平行5頭。分別為空白對(duì)照組、乳酸菌組、中藥發(fā)酵組、中藥水提組、腹瀉模型組，并檢測(cè)其生長(zhǎng)性能、腹瀉率、免疫指標(biāo)、腸道結(jié)構(gòu)和通透性、腸道菌群等指標(biāo)。
（一）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬生長(zhǎng)性能的影響
攻毒大腸桿菌后，模型對(duì)照組平均日增重、平均日采食量與對(duì)照組相比顯著下降，料重比顯著升高，造模成功。各給藥組與模型組相比，顯著提高平均日增重、平均日采食量，顯著降低料重比。發(fā)酵中藥組與空白對(duì)照組相比，顯著提高平均日增重、平均日采食量，顯著降低料重比。發(fā)酵中藥組料重比顯著抵于中藥水提組和乳酸菌組差異。中藥發(fā)酵組對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能有較好的促進(jìn)作用，能顯著提高平均日增重、平均日采食量，降低料重比，效果最優(yōu)。
（二）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬腹瀉率的影響
中藥發(fā)酵液能在較短時(shí)間內(nèi)降低腹瀉率，縮短病程，讓腹瀉仔豬恢復(fù)正常，效果：中藥發(fā)酵組>乳酸菌組>中藥水提組。
（三）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬體液免疫水平的影響
中藥發(fā)酵液、中藥水提液、乳酸菌菌液在攻毒大腸桿菌后，上調(diào)IgG水平，促進(jìn)仔豬體液免疫，中藥發(fā)酵組優(yōu)于純中藥和乳酸菌組。
（四）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬形態(tài)學(xué)分析
模型對(duì)照組十二指腸、回腸、空腸絨毛稀松，較短，具有大量脫離上皮細(xì)胞碎片。空白對(duì)照組因斷奶仔豬腸道發(fā)育不健全，也存在破損現(xiàn)象。中藥發(fā)酵組和乳酸菌組，十二指腸、空腸、回腸絨毛排列緊密，較長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)完整，無脫落和破損現(xiàn)象。
（五）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬小腸絨毛高度、隱窩深度的分析
十二指腸、空腸，尤其是回腸的高度和深度均是中藥發(fā)酵組最好，乳酸菌組次之，總體而言，中藥組相對(duì)會(huì)差一些，這可能與它的定位有關(guān)系。
（六）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬盲腸微生物OTU分析
1. venn diagram分析
OTU（operationaltaxonomic units），即操作分類單元。即相似性聚類分析，用以表現(xiàn)菌群豐度。試驗(yàn)共獲得353 個(gè)不同OTU，其中五組樣品共有的OTU數(shù)是142個(gè)；TCML組中共有 248 個(gè)OUT，5個(gè)特有OUT；LAC組中共有263 個(gè)OTU,18個(gè)特有OUT；NC組中共有242個(gè)OTU,8個(gè)特有OUT；FTCM組中共有264個(gè)OUT，25個(gè)特有OTU。說明仔豬飼喂中藥發(fā)酵物后，特異性O(shè)UT數(shù)量增加，菌群種類豐富。
2. 等級(jí)曲線分析
模型PC組盲腸內(nèi)微生物的OTU等級(jí)曲線坡度最大且橫坐標(biāo)范圍最小。FTCM（中藥發(fā)酵組）等級(jí)曲線最平穩(wěn)且橫坐標(biāo)范圍最大,說明仔豬盲腸中微生物物種分布較均勻，其次是LAC組和TCML組。說明，給藥后，仔豬盲腸中微生物物種增多且分布均勻。
3. 統(tǒng)計(jì)分類學(xué)分析
不同組別盲腸內(nèi)容物微生物在門水平下分類（Phylum）優(yōu)勢(shì)菌群為后壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）。在屬水平上，盲腸微生物主要有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、Subdoligranulum、鏈球菌屬（Streptococcus ）、Catenisphaera、擬桿菌屬（Bacteroides）、Terrisporobacter和Olsenella等，但各處理組之間的差異較大。與NC和PC相比，三個(gè)給藥組（FTCM、TCML和LAC）均增加了乳酸菌Lactobacillus比例，且差異顯著（P<0.05），其中以LAC組含量最高。NC和PC鏈球菌屬（Streptococcus ）的含量分別為3.41%和15.49%，與各給藥組差異顯著。
FTCM:發(fā)酵中藥；NC：空白對(duì)照組；PC：模型對(duì)照組；TCML:中藥水提組；LAC：乳酸菌發(fā)酵液組
（七）對(duì)攻毒大腸桿菌K88仔豬盲腸內(nèi)容物細(xì)菌16S rRNA α多樣性分析
攻毒試驗(yàn)組（PC）Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)均降低，Simpson指數(shù)增高。說明攻毒后，仔豬盲腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性受到影響。發(fā)酵中藥能顯著改善仔豬盲腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性，讓腸道菌群微生物區(qū)系更穩(wěn)固。各處理組的平均覆蓋率均在98.0%以上，說明樣品的測(cè)序數(shù)量已完全能夠反映仔豬盲腸內(nèi)容物中的菌群情況。
四、結(jié)語
中藥發(fā)酵將傳統(tǒng)的中藥理論和現(xiàn)代生物工程技術(shù)有機(jī)結(jié)合，值得深入研究。中藥發(fā)酵是中藥邁上現(xiàn)代化的必經(jīng)之路，強(qiáng)化中藥資源的有效利用，在動(dòng)物醫(yī)學(xué)上意義尤其重大。但對(duì)于方劑和菌種，應(yīng)該根據(jù)畜禽需要，進(jìn)行審慎的選擇和科學(xué)評(píng)價(jià)，切忌想當(dāng)然和主觀臆斷。而發(fā)酵工藝、關(guān)鍵點(diǎn)控制等應(yīng)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，保證產(chǎn)品穩(wěn)定性與可靠性。此外，應(yīng)密切關(guān)注發(fā)酵過程中相關(guān)成分的變化，避害趨利。
相關(guān)鏈接——
△99多功能飼料發(fā)酵劑——高濃度乳酸菌為主的固態(tài)飼料發(fā)酵劑，更輕易成功、效果更好的生物飼料發(fā)酵劑，簡(jiǎn)單好用的中草藥發(fā)酵劑
△中藥發(fā)酵劑，高濃度乳酸菌復(fù)合的益生菌結(jié)合酶制劑的中草藥專業(yè)發(fā)酵劑產(chǎn)品推薦——99多功能飼料發(fā)酵
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